周敏，周雪梅，楊立杰，黃麗波，馮蕾，邵明慧，楊晨，楊維仁，楊在賓，姜淑貞

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院/山東省動(dòng)物工程與疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安 271018）

0 引言

【研究意義】玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEA）主要是由多種鐮刀菌種產(chǎn)生的具有雌激素活性的代謝產(chǎn)物[1-4]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外眾多地區(qū)谷類作物及其加工副產(chǎn)品均不同程度地受到 ZEA的污染[4-6]。飼喂ZEA污染的飼糧引起動(dòng)物食欲降低、繁殖機(jī)能障礙、心臟和肝臟受損等事件屢見不鮮[7-8]，深層次探究ZEA的毒性機(jī)制愈發(fā)刻不容緩?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】研究表明，飼糧50—100 mg·kg-1的 ZEA會(huì)引起母豬外陰發(fā)炎紅腫、陰道和直腸脫落、卵巢畸形、假孕、不孕和流產(chǎn)等癥狀[9]。飼糧中添加 1.1、2.0、3.2 mg·kg-1的ZEA增加仔豬生殖器官指數(shù)，刺激陰戶腫脹，使子宮和卵巢組織結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[10]。戴美玲等[11]證實(shí) ZEA（1.04 mg·kg-1）通過(guò)調(diào)控卵巢中生長(zhǎng)激素受體（GHR）和增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）的高水平表達(dá)誘導(dǎo)斷奶小母豬卵巢提前發(fā)育。STOPA等[12]研究發(fā)現(xiàn)ZEA（50、75 μg·kg-1）及其代謝產(chǎn)物能引起母狗子宮粘膜細(xì)胞凋亡增多。BOUAZIZ 等[13]證實(shí) ZEA（10 μg·mL-1）通過(guò)調(diào)控雌二醇、黃體酮和鈣等多個(gè)信號(hào)通路影響精子的能動(dòng)性，繼而影響人生殖器官的發(fā)育和生殖功能。熱休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）是動(dòng)物機(jī)體在應(yīng)激狀態(tài)下迅速合成的一種高度保守的蛋白[14-17]，能夠減輕應(yīng)激對(duì)機(jī)體的損傷[18]。應(yīng)激狀態(tài)下，機(jī)體內(nèi)的免疫細(xì)胞最先接受刺激信號(hào)，激發(fā)免疫功能，應(yīng)激誘導(dǎo)產(chǎn)生的 HSPs積極參與免疫細(xì)胞的發(fā)育和激活，保證免疫應(yīng)答的正常進(jìn)行[19-22]。冷波等[23]證實(shí)飼糧 1.04 mg·kg-1的 ZEA 上調(diào)斷奶小母豬小腸 HSP70的表達(dá)量?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】有關(guān)ZEA對(duì)動(dòng)物機(jī)體毒性機(jī)理的研究大多是在離體條件下進(jìn)行的，且低劑量ZEA（0.5—1.5 mg·kg-1）對(duì)斷奶小母豬子宮內(nèi)細(xì)胞因子 HSP70的陽(yáng)性分布規(guī)律和表達(dá)量的影響尚未見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本試驗(yàn)選擇斷奶小母豬為試驗(yàn)動(dòng)物，以熱應(yīng)激蛋白家族中含量最多的HSP70為研究對(duì)象，探索低劑量ZEA（0.5—1.5 mg·kg-1）對(duì)斷奶小母豬子宮形態(tài)結(jié)構(gòu)及熱應(yīng)激反應(yīng)的影響，為進(jìn)一步探究 ZEA誘導(dǎo)子宮異常發(fā)育的毒性作用機(jī)制以及ZEA對(duì)斷奶小母豬子宮損傷及抗損傷作用機(jī)制提供參考依據(jù)，以期為生豬生產(chǎn)中防治ZEA的毒性作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

動(dòng)物飼養(yǎng)試驗(yàn)于2016年4—6月在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧科技園進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料

玉米赤霉烯酮（ZEA），購(gòu)于以色列 Fermentek（Jerusalem，Israel）公司，色譜純，純度保證值為98%。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成和營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）1)Table 1 Ingredients and nutrient levels of the basal diet (air dry basis)

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼糧

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選擇25—28日齡健康的三元（杜×長(zhǎng)×大）雜交斷奶雌性仔豬40頭。在產(chǎn)床上繼續(xù)飼養(yǎng)10 d，然后轉(zhuǎn)入試驗(yàn)籠（0.48 m2）。根據(jù)日齡（35—38）和平均體重（14.01 ± 0.86 kg）分成4個(gè)處理，每個(gè)處理10頭，組間初始體重差異不顯著（P＞0.05）。斷奶小母豬基礎(chǔ)飼糧參考NRC（2012）營(yíng)養(yǎng)需要配制，飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表 1。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧（Control），處理 1、2和3組分別在基礎(chǔ)飼糧基礎(chǔ)上添加 0.5（ZEA0.5）、1.0（ZEA1.0）和 1.5（ZEA1.5）mg·kg-1ZEA。仔豬在裝有塑料漏縫地板、乳頭飲水器和料槽的單體籠內(nèi)飼養(yǎng)，自由采食和飲水。試驗(yàn)開始前對(duì)豬舍及周圍的環(huán)境進(jìn)行全面清掃、消毒，試驗(yàn)過(guò)程豬舍每周進(jìn)行一次常規(guī)消毒。舍內(nèi)安裝紅外保溫?zé)簦谝恢芫S持舍內(nèi)溫度在30 ℃左右，之后溫度維持在26—28 ℃左右。豬舍相對(duì)濕度為 65%左右。預(yù)飼期10 d，正式期35 d。仔豬管理和免疫按常規(guī)進(jìn)行。試驗(yàn)結(jié)束后仔豬全部屠宰。

1.2.2 玉米赤霉烯酮污染飼糧的配制 用乙酸乙酯將色譜純度（98%）晶體粉末狀ZEA溶解，將制成的溶液噴灑到一定量的滑石粉載體上，揉搓至充分混合，放置過(guò)夜使乙酸乙酯充分揮發(fā)，制成1 000 mg·kg-1的ZEA預(yù)混劑，然后用不含毒素的玉米粉將 1 000mg·kg-1的ZEA預(yù)混劑稀釋成10 mg·kg-1的ZEA預(yù)混劑，最后根據(jù)各處理飼糧中ZEA的設(shè)計(jì)水平，用ZEA預(yù)混劑替代配方中的玉米和載體配制成試驗(yàn)飼糧，儲(chǔ)存在密封容器中。試驗(yàn)飼糧需要在試驗(yàn)正式開始前一周一次性配合完成，在試驗(yàn)前和試驗(yàn)結(jié)束后分別取樣后，立即進(jìn)行飼糧中養(yǎng)分含量和毒素水平檢測(cè)。取樣方法按照《飼料采樣方法》（GB/T 14699.1-93）。

1.2.3 飼糧常規(guī)養(yǎng)分和毒素的測(cè)定 飼糧常規(guī)養(yǎng)分測(cè)定參考AOAC（2012）的方法進(jìn)行。粗蛋白用凱氏定氮法；鈣根據(jù)高錳酸鉀滴定法測(cè)定；磷根據(jù)鉬黃比色法測(cè)定；氮基酸用日立835-50氮基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行測(cè)定。

飼糧中ZEA、嘔吐毒素、黃曲霉毒素和煙曲霉毒素測(cè)定委托青島出入境檢測(cè)檢疫局測(cè)定。采用免疫親和柱層析凈化，以液相色譜法熒光檢測(cè)器測(cè)定ZEA和黃曲霉毒素的含量，外標(biāo)法定量。采用免疫親和層析凈化高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法，以液相色譜結(jié)合紫外檢測(cè)器測(cè)定煙曲霉毒素和嘔吐毒素的含量，外標(biāo)法定量。黃曲霉毒素、ZEA、嘔吐毒素和煙曲霉毒素的最低檢測(cè)限分別為 1.0 μg·kg-1、0.1、0.1 和 0.25 mg·kg-1。ZEA的實(shí)際測(cè)定值分別為0、0.52 ± 0.07、1.04 ± 0.03和1.51 ± 0.13 mg·kg-1，兩次均未檢測(cè)到其他毒素或者低于檢測(cè)限水平。

1.3 樣品采集與指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 樣品采集 飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束前一天禁食12 h，空腹稱重后將全部動(dòng)物屠宰。剖開腹腔和胸腔，對(duì)生殖器官進(jìn)行肉眼觀察，記錄病變情況，迅速取出兩份子宮，去除周圍的脂肪組織，觀察、測(cè)量并稱重，一份置于2 mL無(wú)RNA酶的凍存管中置液氮中速凍，而后-80℃保存，用于檢測(cè)HSP70的mRNA相對(duì)表達(dá)量；另一份放于 Bouin’s液中固定，用于檢測(cè)子宮形態(tài)學(xué)的結(jié)構(gòu)和HSP70的陽(yáng)性分布規(guī)律。

1.3.2 蘇木精-伊紅染色（H.E.染色法） 將Bouin’s液中固定好的子宮組織進(jìn)行切割修整，放于流水中沖洗至組織原色，經(jīng)乙醇逐級(jí)脫水，經(jīng)二甲苯透明，采用 BMJ23型包埋機(jī)進(jìn)行包埋。用切片機(jī)（LEICA RM2235，Germany）進(jìn)行切片，片厚5—6 um。切片依次經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水至蒸餾水。蘇木素染色6 min；在鹽酸酒精中分化，藍(lán)化15—20 min；伊紅染色 1 min，酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。采用Nikon ELIPSE 80i共聚焦熒光顯微鏡（日本）觀察子宮的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)并拍照。

1.3.3 免疫組織化學(xué)法（超敏二步法） （1）石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水；（2）檸檬酸緩沖液（0.01 mol·L-1，pH 6.0）進(jìn)行抗原熱修復(fù)，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）（0.01mol·L-1，pH 7.2）沖洗 5 min×3（下同）；（3）10%H2O237℃避光孵育1 h，PBS洗3次；（4）10%山羊血清37℃封閉孵育1 h；（5）加鼠抗HSP70（1:50）單克隆抗體（BM0368，武漢博士德生物工程有限公司），4℃過(guò)夜孵育；（6）37℃復(fù)溫，PBS洗3次；（7）二抗為抗鼠 Polink-2 plus? 超敏二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒（PV-9002，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）（8）二氨基聯(lián)苯胺（DAB）（TIANGEN coad：PA110，Lot：P4819）顯色，顯微鏡下觀察顯色程度，控制顯色時(shí)間；（9）蘇木素復(fù)染，分色、脫水、透明，中性樹膠封片，顯微鏡下明亮視野觀察免疫陽(yáng)性細(xì)胞分布規(guī)律，拍照、留存。

1.3.4 子宮熱應(yīng)激蛋白70（HSP70）的累積光密度值（IOD）測(cè)定 用Nikon ELIPSE 80i共聚焦熒光顯微鏡（日本）觀察子宮組織切片。每頭豬子宮切片隔10張切片取1張，共取5張。使用Image Pro-Plus 6.0軟件統(tǒng)計(jì)分析子宮切片橫斷面IOD。

1.3.5 熱應(yīng)激蛋白70（HSP70）mRNA相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定 根據(jù)Genbank已報(bào)道的豬的HSP70和GAPDH基因序列，利用Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)相應(yīng)引物，并由華大基因合成（表2）。

取 50—70 mg -80℃保存的子宮樣品，按 Trizol法提取總RNA，利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其純度及濃度，吸光度(OD) 比值保持在 1.8—2.0之間。按照PrimeScript PMRT Master Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR036A，Applied TaKaRa，大連）說(shuō)明書進(jìn)行操作，反應(yīng)體積為20μL。

qRT-PCR的反應(yīng)體系體積為20 uL，按照SYBR Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）（Takara coad：RR420A，Lot：AK7502）試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，每個(gè)樣品設(shè)置三個(gè)重復(fù)。使用ABI 7 500 Realtime熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s，95℃變性 5 s，60℃退火延伸 34 s，95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s，循環(huán)次數(shù)為43。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用 2-ΔΔCt對(duì)熒光定量 PCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，對(duì)HSP70基因 mRNA在子宮中的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)采用SAS 9.2統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因子方差（One-Way ANOVA）分析，P＜0.05為差異顯著，P＜0.001為差異極顯著。采用IPP 6.0圖像分析軟件，對(duì)子宮HSP70的累積光密度（IOD）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 玉米赤霉烯酮對(duì)斷奶小母豬子宮形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)的影響

飼糧中添加不同水平 ZEA對(duì)斷奶小母豬子宮形態(tài)學(xué)的影響見圖 1。分析表明，對(duì)照組子宮肌層及內(nèi)膜較?。ˋ1），子宮腺分布分散且密度?。ˋ2）；隨著飼糧中ZEA水平的升高，子宮肌層厚度（B1、C1和D1的黑色箭頭）和內(nèi)膜厚度（B1、C1和D1的黃色箭頭）明顯增厚，子宮腺數(shù)量顯著增多，密度明顯增大。隨著飼糧中ZEA水平的升高，子宮肌層及內(nèi)膜厚度呈一次（P＜0.001）和二次（P＜0.001）線性升高（表 3）；與對(duì)照組相比，0.5、1.0和 1.5 mg·kg-1ZEA處理的子宮肌層及內(nèi)膜厚度顯著增加（P＜0.05）；3個(gè)ZEA處理組相比，1.5 mg·kg-1處理的子宮肌層和內(nèi)膜厚度顯著高于1.0 mg·kg-1處理（P＜0.05），而1.0 mg·kg-1處理的子宮肌層和內(nèi)膜厚度又顯著高于 0.5 mg·kg-1處理（P＜0.05）。

表2 HSP70和GAPDH的基因引物序列Table 2 Primer sequences of HSP70 and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase（GAPDH）

圖1 玉米赤霉烯酮對(duì)斷奶小母豬子宮形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)的影響Fig. 1 Effects of zearalenone on photomicrographs of hematoxylin and eosin stained uterus of post-weaning gilts

2.2 玉米赤霉烯酮對(duì)斷奶小母豬子宮熱應(yīng)激蛋白 70（HSP70）分布的影響

飼糧中添加不同水平 ZEA對(duì)斷奶小母豬子宮HSP70分布的影響見圖2。免疫組化結(jié)果顯示斷奶小母豬子宮中的HSP70陽(yáng)性細(xì)胞主要分布在肌層平滑肌細(xì)胞、腔上皮細(xì)胞、子宮腺上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)，陽(yáng)性反應(yīng)物質(zhì)呈黃色和棕黃色，胞質(zhì)著色，偶見胞核著色。對(duì)照組中子宮肌層平滑肌細(xì)胞、子宮腺上皮細(xì)胞、腔上皮細(xì)胞和血管上皮細(xì)胞免疫陽(yáng)性分布較弱，HSP70陽(yáng)性呈淡黃色均勻分布；ZEA處理組的HSP70免疫陽(yáng)性物質(zhì)分布規(guī)律與對(duì)照組基本一致（紅色箭頭），但隨著飼糧中 ZEA水平的升高，HSP70免疫陽(yáng)性反應(yīng)逐漸增強(qiáng)，陽(yáng)性物質(zhì)著色加深。HSP70累積光密度（IOD）結(jié)果（表4）表明，隨著飼糧中ZEA水平的升高，斷奶小母豬子宮中肌層、腺上皮、腔上皮及總 HSP70免疫陽(yáng)性物質(zhì)的 IOD均呈一次（P＜0.001）和二次（P＜0.05）線性升高；總體上，1.5 mg·kg-1處理的子宮 HSP70免疫陽(yáng)性物質(zhì)的 IOD顯著高于 0.5 mg·kg-1處理（P＜0.05），0.5和 1.0 mg·kg-1處理的子宮HSP70免疫陽(yáng)性物質(zhì)的IOD又顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。其中，1.5 mg·kg-1處理的子宮肌層 IOD 顯著高于 1.0 mg·kg-1處理（P＜0.05），1.0 mg·kg-1處理的子宮肌層 IOD 又顯著高于 0.5 mg·kg-1處理和對(duì)照組（P＜0.05）；1.0和1.5 mg·kg-1處理的子宮腔上皮IOD顯著高于0.5 mg·kg-1處理（P＜0.05），0.5 mg·kg-1處理的子宮腔上皮IOD又顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；1.5 mg·kg-1處理的子宮腺上皮IOD顯著高于 1.0 mg·kg-1處理（P＜0.05），1.0 mg·kg-1處理的子宮腺上皮IOD顯著高于0.5 mg·kg-1處理（P＜0.05），0.5 mg·kg-1處理的子宮腺上皮IOD又顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

表3 ZEA對(duì)斷奶小母豬子宮肌層和內(nèi)膜厚度（40倍鏡下測(cè)量）的影響Table 3 Effects of zearalenone on myometrial and endometrial thickness measured in 40 times of uterus in postweaning piglets

圖2 玉米赤霉烯酮對(duì)斷奶小母豬子宮HSP70分布的影響Fig. 2 Effects of zearalenone on the HSP70 distribution in the uterus of post-weaning gilts

表4 玉米赤霉烯酮對(duì)斷奶小母豬子宮不同部位HSP70陽(yáng)性反應(yīng)的累積光密度的影響Table 4 The effects of zearalenone on the immunoreactive integrated optic density (IOD) of HSP70 in the different parts of the uterus in post-weaning gilts（×103）

2.3 玉米赤霉烯酮對(duì)斷奶小母豬子宮熱應(yīng)激蛋白 70（HSP70）的mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

熱應(yīng)激蛋白 70（HSP70）的 mRNA相對(duì)表達(dá)量與免疫組化結(jié)果顯示的免疫陽(yáng)性一致（圖 3）。隨著飼糧 ZEA水平的升高，斷奶小母豬子宮 HSP70的mRNA 相對(duì)表達(dá)量呈一次（P＜0.001）和二次（P＜0.001）線性升高。與對(duì)照組相比，0.5、1.0 和 1.5 mg·kg-1ZEA處理的子宮HSP70的mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著升高（P＜0.05）；3個(gè)ZEA處理組相比，1.5 mg·kg-1處理的子宮HSP70的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于0.5 mg·kg-1處理（P＜0.05）。

3 討論

國(guó)內(nèi)外關(guān)于 ZEA毒性的研究大多是利用已知ZEA含量的天然污染飼糧進(jìn)行的[24]，但是天然污染飼糧中其它毒素會(huì)帶來(lái)一定的干擾。本試驗(yàn)選擇高純度的ZEA添加到飼糧，在筆者前期研究結(jié)果的基礎(chǔ)上[10,25-30]，進(jìn)一步探索低劑量ZEA（0—1.5 mg·kg-1）對(duì)斷奶小母豬子宮形態(tài)學(xué)及子宮 HSP70分布和mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響。

圖3 玉米赤霉烯酮對(duì)斷奶小母豬子宮HSP70的mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響Fig. 3 Effects of zearalenone on relative mRNA expression of HSP70 in the uterus of post-weaning gilts

本試驗(yàn)條件下，飼糧中添加0.5—1.5 mg·kg-1ZEA對(duì)小母豬的平均日采食量、平均日增重和料重比均沒有顯著影響[31]，關(guān)于ZEA水平對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)性能的機(jī)理研究，還需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。

3.1 對(duì)斷奶小母豬子宮形態(tài)學(xué)的影響

玉米赤霉烯酮具有類雌激素的作用，其作用的靶器官主要是雌性動(dòng)物的生殖系統(tǒng)。ZEA能與雌激素受體結(jié)合，誘發(fā)母豬雌激素過(guò)多癥，典型的癥狀為陰戶濕腫、陰道脫垂、子宮增生及乳腺增大等[32]。ZEA和α-玉米吃霉烯醇（α-ZOL）都能夠競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合 17β-雌二醇，誘導(dǎo)雌激素過(guò)多癥，隨后激活基因表達(dá)，提高細(xì)胞核內(nèi)RNA聚合酶的活性，RNA合成增加，提高相關(guān)蛋白質(zhì)的合成，引起生殖器官的功能和形態(tài)變化[33-35]。先前有研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加ZEA（0.5、2.0 mg·kg-1）可增加后備母豬的子宮重量和陰戶寬度，同時(shí)這一趨勢(shì)與子宮粘膜肌層變厚、腺體增生等形態(tài)變化相一致[36]。類似地，飼糧中添加ZEA（1.1、2.0、3.2 mg·kg-1）可引起斷奶小母豬子宮肌層平滑肌增生且具有劑量依賴特性，這一結(jié)果與子宮重量以及生殖器官指數(shù)的增大相一致[30]。近期研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加 1.04 mg·kg-1能顯著增加生殖器官的相對(duì)重量，并且通過(guò)調(diào)控卵巢中GHR和PCNA的高水平表達(dá)促使斷奶仔豬卵巢提前發(fā)育[11]。綜上所述，推測(cè)玉米赤霉烯酮誘導(dǎo)豬子宮肥大與形態(tài)學(xué)變化基本一致。0.5—1.5 mg·kg-1對(duì)斷奶小母豬子宮形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)的影響尚未見報(bào)道，本試驗(yàn) H.E.染色結(jié)果表明，子宮內(nèi)膜和肌層的厚度隨ZEA濃度的增加顯著增厚，子宮腺體密度增大，表明 ZEA（0.5—1.5 mg·kg-1）在一定程度上對(duì)試驗(yàn)小母豬生殖器官產(chǎn)生毒害作用，這與前人的研究結(jié)果相一致。盡管ZEA誘導(dǎo)母豬子宮肥大得到研究證實(shí)，但對(duì)其作用機(jī)制的研究還需要更深層次的研究。

3.2 玉米赤霉烯酮對(duì)斷奶小母豬子宮熱應(yīng)激蛋白 70（HSP70）表達(dá)的影響

關(guān)于ZEA引起動(dòng)物機(jī)體的氧化應(yīng)激已得到證實(shí)。ABID-ESSEFI等[37]研究發(fā)現(xiàn)，ZEA（10、20、40μmol·L-1）能降低細(xì)胞活性，抑制蛋白質(zhì)和DNA生成，丙二醛（MDA）含量提高，細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損，引起應(yīng)激反應(yīng)。2.0和3.2 mg·kg-1ZEA引起斷奶小母豬肝臟超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過(guò)氧物酶（GSH-PX）活性下降，MDA明顯上升，造成肝臟氧化損傷，證實(shí)氧化應(yīng)激是ZEA代謝產(chǎn)物毒性的又一機(jī)制[30]。ZEA顯著提高大鼠血漿葡萄糖、乳酸、N-乙?；堑鞍?、O-乙?；堑鞍缀捅岬乃?，顯著降低血漿絡(luò)氨酸、支鏈氨基酸、膽堿的水平，提示ZEA具有強(qiáng)氧化作用[38]。因此，推測(cè)ZEA對(duì)動(dòng)物機(jī)體造成一定程度的損傷作用。熱應(yīng)激蛋白70（HSP70）是HSP家族中最重要的蛋白，分布在各種細(xì)胞中，并具有廣泛的細(xì)胞保護(hù)作用，對(duì)于生物體抵抗和適應(yīng)不良環(huán)境有著十分重要的意義[39-41]。報(bào)道表明，熱應(yīng)激蛋白除了因熱休克刺激產(chǎn)生外，氧化性損傷、重金屬、亞砷酸鈉、氨基酸類似物等都可以誘導(dǎo)其高水平表達(dá)[23]。本研究免疫組化及 mRNA相對(duì)表達(dá)量結(jié)果顯示，隨著飼糧中ZEA水平的升高，HSP70免疫陽(yáng)性反應(yīng)明顯增強(qiáng)，并且檢測(cè)到mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高，表明ZEA對(duì)小母豬子宮產(chǎn)生了一定程度的毒害作用，從而導(dǎo)致子宮為了抵抗毒素的應(yīng)激而高表達(dá)HSP70，以減輕毒素應(yīng)激帶來(lái)的損傷[23]。盡管HSP70的分子伴侶功能、抗細(xì)胞凋亡作用、抗氧化作用、參與細(xì)胞耐熱和細(xì)胞保護(hù)等作用被大多數(shù)學(xué)者認(rèn)同，但是HSP70對(duì)動(dòng)物機(jī)體的作用機(jī)制及其和氧化應(yīng)激與生殖毒性的相關(guān)性還需要更深入、全面的研究。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)條件下，0.5 mg·kg-1及其以上水平的玉米赤霉烯酮可顯著改變斷奶小母豬子宮形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)子宮熱應(yīng)激蛋白70免疫陽(yáng)性物質(zhì)分布（IOD），上調(diào)熱應(yīng)激蛋白 70的 mRNA相對(duì)表達(dá)量，提示 0.5 mg·kg-1玉米赤霉烯酮足以誘導(dǎo)子宮組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)和應(yīng)激反應(yīng)，對(duì)生殖器官造成損傷，通過(guò)調(diào)控子宮內(nèi)熱應(yīng)激蛋白 70高水平表達(dá)可以抵抗玉米赤霉烯酮對(duì)子宮細(xì)胞的損傷。

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