楊玉霞， 陳雪飛， 張 美， 胡 平， 夏燕莉， 詹志來(lái)， 曹 柳，3

(1.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，四川成都 610041； 2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心，北京 100700； 3.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院/四川省人民醫(yī)院，四川成都 610072)

虎杖為蓼科植物虎杖(PolygonumcuspidatumSieb. et Zucc.)的干燥根莖和根，性微苦，微寒，具有祛風(fēng)利濕、散瘀定痛、止咳化痰的功效，臨床上主要用于關(guān)節(jié)痹痛、濕熱黃疸、經(jīng)閉、咳嗽痰多、水火燙傷、跌打損傷、癰腫瘡毒等病癥的治療[1]，其主要有效成分為虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素等。其中，虎杖苷具有鎮(zhèn)咳、保肝、抗休克及抑制血小板聚集等作用[2-4]；大黃素有較廣泛的生物活性，具有抑菌、抗炎、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤等作用[5-6]。《中華人民共和國(guó)藥典》中虎杖項(xiàng)下以大黃素、虎杖苷的含量作為虎杖的質(zhì)量控制指標(biāo)[1]。近年來(lái)，由于過(guò)度采挖，野生虎杖資源遭受嚴(yán)重破壞，因此人工栽培成為解決虎杖資源枯竭問(wèn)題、滿足市場(chǎng)需求的有效途徑之一。

主成分分析法是將眾多指標(biāo)性狀轉(zhuǎn)化為少數(shù)綜合指標(biāo)的一種統(tǒng)計(jì)分析方法，將復(fù)雜問(wèn)題通過(guò)降維方式變得簡(jiǎn)單直觀，目前已被廣泛應(yīng)用于果蔬品質(zhì)評(píng)價(jià)因子的篩選和品質(zhì)的綜合評(píng)價(jià)。虎杖具有豐富的遺傳多樣性，其經(jīng)濟(jì)性狀尚待深入研究。有學(xué)者主要對(duì)虎杖的化學(xué)成分[7-12]、藥理作用[13-21]及臨床應(yīng)用[22-27]等進(jìn)行了研究，尚未有采用主成分和聚類分析方法綜合研究虎杖產(chǎn)量和品質(zhì)的報(bào)道。本試驗(yàn)以19份虎杖作為研究對(duì)象，通過(guò)主成分及聚類分析方法對(duì)其產(chǎn)量和品質(zhì)性狀進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，以尋求虎杖產(chǎn)量與品質(zhì)評(píng)價(jià)的主要因素，為構(gòu)建川產(chǎn)虎杖的產(chǎn)量和質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)體系提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料來(lái)源于四川省樂(lè)山市、雅安市、廣安市、巴中市及重慶市等地，共19份，均為野生居群，經(jīng)四川省中醫(yī)藥科學(xué)院舒光明研究員鑒定為虎杖(Polygonumcuspidatum)。樣品來(lái)源如表1所示。

表1 供試材料編號(hào)及來(lái)源

1.2 儀器與試劑

主要儀器有Agilent 1200高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)、UV-1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司)、電子分析天平(德國(guó)Sartorius BS110S型十萬(wàn)分之一)、KQ2200型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、DHG-9140電熱鼓風(fēng)干燥箱。

主要試劑有虎杖苷對(duì)照品(成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)：MUST-15051307)、大黃素對(duì)照品(成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)：MUST-15042711)，純度均大于98%；乙腈(批號(hào)：905904)、甲醇(批號(hào)：905900)均為色譜純，均購(gòu)自美國(guó)天地有限公司；水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 田間試驗(yàn) 2013至2015年在四川省樂(lè)山市犍為縣五四村虎杖試驗(yàn)地進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)地之前種植的作物為玉米，地勢(shì)平坦，肥力均勻，壤土，土壤理化性質(zhì)為pH值7.53，全鉀、全氮、全磷、有機(jī)質(zhì)的含量分別為46.77、0.72、0.15、94.40 g/kg，速效氮、有效磷、速效鉀含量分別為154.40、56.27、184.35 mg/kg。采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，重復(fù)3次，小區(qū)面積為3.6 m2(3.0 m×1.2 m)，株行距為40 cm×60 cm，共6行，每行4株，每小區(qū)共栽種24株，栽培及田間管理同大田生產(chǎn)中各項(xiàng)措施。2015年8月隨機(jī)取10株虎杖，考察株高、莖粗、主莖葉數(shù)、分枝數(shù)及單株產(chǎn)量(以單株根及根莖鮮質(zhì)量計(jì))等農(nóng)藝性狀，并以平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.2 虎杖苷及大黃素含量的測(cè)定

1.3.2.1 色譜條件 色譜柱為Zorbax Eclipse C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脫(0～13 min，20%～40% A；13～22 min，40%～80% A；22～23 min，80%～20% A)；流速為1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為299 nm；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。

1.3.2.2 混合對(duì)照品溶液的制備 取虎杖苷和大黃素對(duì)照品適量，精確稱定，加入甲醇配制成含226 μg/mL虎杖苷、217 μg/mL大黃素的對(duì)照品溶液。精確吸取3 mL虎杖苷對(duì)照品溶液、2 mL大黃素對(duì)照品溶液于10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，得到混合對(duì)照品溶液。

1.3.2.3 供試品溶液的制備 精確稱取各產(chǎn)地0.1 g的虎杖粉末置于具塞錐形瓶中，加入25 mL甲醇，精確稱定質(zhì)量，超聲處理(功率100 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，取上清液用微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò)，得到供試品溶液。

1.3.2.4 線性關(guān)系考察 分別精確吸取0.1、0.5、1.0、3.0、5.0、8.0、10.0、12.0、15.0、20.0 μL大黃素對(duì)照品溶液注入液相色譜儀，按 “1.3.2.1” 節(jié)下色譜條件測(cè)定大黃素峰面積，以對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(x)，以峰面積為縱坐標(biāo)(y)進(jìn)行回歸分析，得回歸方程：y虎杖苷=114 8.4x+54.279 0(r=0.999 8)；y大黃素=1 594.2x+0.340 1(r=0.999 9)，虎杖苷在0.018 1～3.616 0 μg、大黃素在0.004 3～0.868 0 μg內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

1.3.2.5 樣品測(cè)定 取適量供試材料樣品，按“1.3.2.3”節(jié)中的方法制備供試品溶液，同時(shí)按“1.3.2.1”節(jié)中色譜條件測(cè)定，采用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算虎杖藥材中虎杖苷及大黃素含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)平均值、標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)的分析；利用DPS 7.05軟件[28]進(jìn)行相關(guān)、主成分及聚類分析；依據(jù)方差累計(jì)貢獻(xiàn)率≥85%的標(biāo)準(zhǔn)提取主成分，以各主成分對(duì)應(yīng)的方差貢獻(xiàn)率作為權(quán)重，對(duì)主成分得分和相應(yīng)的權(quán)重進(jìn)行線性加權(quán)，構(gòu)建川產(chǎn)虎杖居群的評(píng)價(jià)函數(shù)；主成分聚類分析按歐式距離類平均法進(jìn)行系統(tǒng)聚類。

2 結(jié)果與分析

2.1 虎杖主要農(nóng)藝性狀、虎杖苷及大黃素含量表現(xiàn)

由表2可以看出，虎杖不同居群間10個(gè)農(nóng)藝性狀以及虎杖苷、大黃素含量的變異幅度較大。

表2 虎杖主要農(nóng)藝性狀、虎杖苷及大黃素含量的表現(xiàn)

變異系數(shù)是衡量性狀表現(xiàn)的差異程度、變異范圍的量。供試材料12個(gè)性狀的變異系數(shù)存在明顯差異，變異系數(shù)由大到小排序?yàn)榇簏S素含量>虎杖苷含量>分枝數(shù)>莖葉鮮質(zhì)量>冠幅>莖粗>主根粗>主根長(zhǎng)>單株產(chǎn)量>側(cè)根數(shù)>主莖葉數(shù)>株高。大黃素含量、虎杖苷含量、分枝數(shù)、莖葉鮮質(zhì)量的變異系數(shù)較大，均在25%以上，說(shuō)明這些性狀選擇的潛力大，受環(huán)境影響較大。株高、主莖葉數(shù)、側(cè)根數(shù)的變異系數(shù)相對(duì)較小，均在15%以下，說(shuō)明這些性狀由本身內(nèi)在因素決定，受環(huán)境因素的影響較小。因此，改善環(huán)境，提高分枝數(shù)、莖葉鮮質(zhì)量，進(jìn)而提高單株產(chǎn)量以及大黃素、虎杖苷的含量是實(shí)現(xiàn)虎杖高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的有效途徑。

2.2 虎杖主要農(nóng)藝性狀、虎杖苷及大黃素含量的主成分分析

對(duì)虎杖主要性狀進(jìn)行主成分分析，結(jié)果表明，前5個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率為88.724%>85.000%(表3)，說(shuō)明前5個(gè)主成分已基本包含了虎杖性狀的全部信息，可用前5個(gè)主成分對(duì)其進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。第1主成分的特征值為3.736，貢獻(xiàn)率為31.134%。決定第1主成分的主要是株高、莖粗、主莖葉數(shù)、冠幅及單株產(chǎn)量，其載荷值均為正值，稱為株型產(chǎn)量因子。第2主成分的特征值為3.201，貢獻(xiàn)率為26.677%，決定第2主成分的主要是主根長(zhǎng)、側(cè)根數(shù)，其次為主根粗，其載荷值均為正值，稱之為根型因子。第3主成分的特征值為 1.942，貢獻(xiàn)率為16.184%，起決定作用的是分枝數(shù)，稱為分枝因子。第4主成分的特征值為1.050，貢獻(xiàn)率為8.750%，起決定作用的為虎杖苷含量及莖粗，其載荷值為較大正值，稱為虎杖苷-莖粗因子。第5成分的特征值為0.717，貢獻(xiàn)率為 5.979%，起決定作用的是虎杖苷及大黃素含量，其載荷值均為正值，而單株產(chǎn)量的載荷值為較大負(fù)值，稱為優(yōu)質(zhì)低產(chǎn)因子。

2.3 不同虎杖居群的綜合評(píng)價(jià)

以各主成分對(duì)應(yīng)的方差貢獻(xiàn)率作為權(quán)重，對(duì)主成分得分和相應(yīng)的權(quán)重進(jìn)行線性加權(quán)，構(gòu)建虎杖評(píng)價(jià)函數(shù)：F=0.311 3F1+0.266 8F2+0.161 8F3+0.087 5F4+0.059 8F5，計(jì)算各居群的綜合評(píng)價(jià)分值，分值越高表示該居群綜合評(píng)價(jià)越好。

表3 5個(gè)主成分的特征值、貢獻(xiàn)率、累計(jì)貢獻(xiàn)率及其特征向量

在主成分綜合統(tǒng)計(jì)結(jié)果基礎(chǔ)上計(jì)算出供試的19份虎杖的產(chǎn)量和品質(zhì)的綜合評(píng)價(jià)得分(表4)。結(jié)果表明，在所有的供試材料中，來(lái)自重慶市奉節(jié)縣小寨天坑(材料19)的評(píng)價(jià)得分最高(1.992)，其次為材料15和材料10，其綜合評(píng)分均在0.700以上，材料7和材料9的評(píng)價(jià)得分均在-1.000以下，編號(hào)為2、3、18等8份材料的評(píng)價(jià)得分在-0.700～0.000內(nèi)，來(lái)自成都市大邑縣出江鎮(zhèn)香桂村1組(材料7)的評(píng)價(jià)得分最低(-1.343)。

2.4 虎杖產(chǎn)量與品質(zhì)性狀的聚類分析

根據(jù)不同產(chǎn)地虎杖居群產(chǎn)量與品質(zhì)性狀，可將19份種質(zhì)資源分成3類。由表5、圖1可以看出，材料19單獨(dú)成Ⅰ類，該類分枝數(shù)最多、主根長(zhǎng)較長(zhǎng)，其他性狀中等偏上，屬于高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)型材料。第Ⅱ類由3、4、7、18等9份材料組成，該類側(cè)根數(shù)最多，虎杖苷含量最高，株高、莖粗、主莖葉數(shù)、單株產(chǎn)量、大黃素含量等均最低，屬于矮稈低產(chǎn)型材料。第Ⅲ類由1、2、5、17等9份材料組成，此類材料株高、莖粗、主莖葉數(shù)、冠幅、莖葉鮮質(zhì)量、單株產(chǎn)量、大黃素含量均最高，但虎杖苷含量最低，屬于高產(chǎn)高大黃素含量型材料。

表4 19份虎杖的產(chǎn)量與品質(zhì)的綜合評(píng)價(jià)得分

表5 基于虎杖主要農(nóng)藝性狀及虎杖苷及大黃素含量的分類

3 結(jié)論與討論

在所有的供試材料中，材料19的綜合得分最高，為 1.992；其次為材料15，綜合得分為0.936。但從產(chǎn)量而言，15號(hào)材料表現(xiàn)較優(yōu)，其單株產(chǎn)量較高、分枝數(shù)較多、莖葉鮮質(zhì)量較高，虎杖苷與大黃素的含量也較高，值得進(jìn)一步選育推廣。本試驗(yàn)分析的是各農(nóng)藝性狀對(duì)單株產(chǎn)量的結(jié)果，對(duì)于群體產(chǎn)量結(jié)果如何，還要進(jìn)一步探討。

在各種問(wèn)題的多指標(biāo)分析中，指標(biāo)的數(shù)量多又相互關(guān)聯(lián)，分析工作比較困難。多元統(tǒng)計(jì)的主成分分析是指在不損失或很少損失原有信息的前提下，將原來(lái)數(shù)量較多而且彼此相關(guān)的指標(biāo)轉(zhuǎn)換為新的數(shù)量少而彼此獨(dú)立或不相關(guān)的綜合指標(biāo)，從而簡(jiǎn)化多指標(biāo)分析[29]。很多研究表明，用主成分分析方法進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)是一種有效的方法[30-31]。本試驗(yàn)采用主成分分析方法，將19份虎杖種質(zhì)資源的10個(gè)農(nóng)藝性狀和2個(gè)質(zhì)量性狀簡(jiǎn)化為彼此不相關(guān)的綜合指標(biāo)(主成分)，即株型產(chǎn)量因子、根型因子、分枝因子、虎杖苷-莖粗因子和優(yōu)質(zhì)低產(chǎn)因子，這5個(gè)主成分對(duì)總變異的累積貢獻(xiàn)率約達(dá)85.000%以上。從主成分綜合質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果可以看出，3類虎杖種質(zhì)資源均有各自不同的優(yōu)良特性，可從中選擇優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源并加以推廣，加快虎杖優(yōu)良品種的選育工作。

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