致犢牛腦炎β-溶血性牛鏈球菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

宋 健， 高建鵬， 龔子桓， 王蒙蒙， 齊亞銀

(石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832000)

鏈球菌屬(Streptococcus)是一群觸酶試驗(yàn)陰性、呈鏈狀排列的革蘭氏陽性菌，該菌屬種類繁多，目前臨床上仍沿用Lancefield血清學(xué)方法進(jìn)行分群(A、B、C、D、F、G等18個(gè)群)或根據(jù)溶血現(xiàn)象(β溶血、α溶血或草綠色溶血、γ溶血或不溶血)進(jìn)行分類，近年來鏈球菌屬的分類發(fā)生了一些變化，提出了新的菌群劃分概念。醫(yī)學(xué)上重要的鏈球菌主要有化膿性鏈球菌、草綠色鏈球菌、肺炎鏈球菌、無乳鏈球菌、牛鏈球菌等，是人類重要的病原之一，可引起敗血癥、肺炎及腦膜炎等疾病，同時(shí)也是其他多脊椎動(dòng)物如豬、牛等重要病原菌之一。

2015年初冬，新疆奎屯某規(guī)?；龅牟糠譅倥０l(fā)生了以腦炎為主的病例，3～30日齡發(fā)病不等，發(fā)病犢牛表現(xiàn)體溫升高、咳嗽、共濟(jì)失調(diào)、頭低耳耷、眼球嚴(yán)重外突、拱背、精神沉郁、消瘦、抗生素治療效果不佳。剖檢瀕死期犢牛發(fā)現(xiàn)，腦膜嚴(yán)重化膿(圖1)，肺臟出血且有肉變，腎盂出血，小腸嚴(yán)重出血，腸黏膜脫落，腸系膜淋巴結(jié)腫大。

為查明導(dǎo)致該病發(fā)生的主要致病菌，筆者為牛場提供了科學(xué)合理的治療方案，即采用常規(guī)微生物學(xué)手段和方法，對患腦炎的犢牛進(jìn)行病原菌的分離和鑒定，并對分離株溶血性及藥物敏感性進(jìn)行測定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基與生化試劑 LB肉湯培養(yǎng)基，普通瓊脂培養(yǎng)基，鏈球菌肉湯培養(yǎng)基，10%滅活綿羊血瓊脂培養(yǎng)基、鏈球菌選擇培養(yǎng)基。各種生化試驗(yàn)用培養(yǎng)基等參照文獻(xiàn)[1]配制，4 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆茫患?xì)菌微量發(fā)酵管購自于浙江省杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.2 主要器械 超凈工作臺(tái)，上海鴻都電子科技有限公司；隔水式恒溫培養(yǎng)箱，北京市永光明醫(yī)療儀器廠；4 ℃ 冰箱，海信容聲冰箱有限公司。

1.1.3 藥敏試驗(yàn) 萬古霉素、阿奇霉素、四環(huán)素、青霉素、阿莫西林、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、羅紅霉素、卡那霉素、慶大霉素等藥敏紙片為浙江省杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 樣品來源 無菌采集新疆奎屯某發(fā)病牛場的犢牛肝臟、腸系膜淋巴結(jié)、脾臟、心血、肺臟、腦等共6份，分別放入滅菌的培養(yǎng)皿內(nèi)，然后在放入帶有冰塊泡沫箱內(nèi)密封并盡快帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2.2 分離培養(yǎng) 無菌采集瀕死期及死亡的犢牛的肝臟、心血、肺臟、腦，接種于LB肉湯培養(yǎng)基，置37 ℃恒溫箱中增菌培養(yǎng)24 h后，革蘭染色鏡檢，初步篩選出革蘭陽性球菌，再通過四區(qū)劃線法將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于普通瓊脂平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。觀察菌落形態(tài)并染色鏡檢，挑選可疑革蘭陽性球菌的單個(gè)菌落接種于鏈球菌肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱24 h后，染色鏡檢。隨后將菌液接種于鏈球菌選擇性培養(yǎng)基上，置于含體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2恒溫(37 ℃)培養(yǎng)箱中進(jìn)行分離純化，培養(yǎng)12 h后挑選單個(gè)菌落，接于10%滅活綿羊鮮血LB平板上，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌菌落形態(tài)和溶血情況。

1.2.3 生化鑒定 分離菌的生化鑒定，參照文獻(xiàn)[2-3]的方法進(jìn)行。將分離菌株分別接種于含甘露醇、山梨醇、馬尿酸鈉、甘油、海藻糖、蔗糖、果糖、七葉苷、阿拉伯糖、菊糖、棉子糖、鼠李糖等微量生化反應(yīng)管中，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察其生化反應(yīng)特性。

1.2.4 藥敏試驗(yàn) 采用K-B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，參照趙占峰等根據(jù)NCCLS(美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì))標(biāo)準(zhǔn)判定試驗(yàn)結(jié)果[4]。將所保存的純化菌株分別在37 ℃營養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)18～24 h，用無菌生理鹽水將菌液稀釋至濃度約為2×106個(gè)/mL，用無菌棉拭子蘸取菌液，均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂平板。每個(gè)平板貼6張藥敏紙片為宜，2張紙片相距 25 mm，紙片與平板邊緣10～15 mm，并輕按紙片中心，使其附著嚴(yán)密，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。測量抑菌圈直徑，判定鏈球菌對藥敏紙片的敏感性，判定標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 藥敏試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)

注：“R”為耐藥；“I”為中度敏感；“S”為高度敏感。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌形態(tài)觀察

病死犢牛的肺臟，肝臟和心血抹片瑞氏染色鏡檢，均有球菌，腦組織抹片瑞士染色鏡檢，可見短鏈和成對排列的球菌(圖2)。病死犢牛腦組織分離培養(yǎng)物革蘭染色呈鏈狀排列的革蘭氏陽性球菌(圖3)。

2.2 病原菌分離培養(yǎng)及溶血特性

病變組織無菌接入肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，溶液變渾濁。在普通瓊脂上生長貧瘠且緩慢；在鏈球菌選擇培養(yǎng)基上為白色隆起，邊緣整齊的針尖大小菌落；在體積分?jǐn)?shù)為5% CO2中生長良好。分離菌在10%滅活綿羊血瓊脂平板上菌落灰白色、半透明、表面光滑、圓形、邊緣整齊，有溶血現(xiàn)象，直徑為2.20～2.41 mm，呈現(xiàn)β溶血(圖4)。

2.3 生化特性

分離菌觸酶試驗(yàn)為陰性，在pH值9.6、6.5% NaCl中不生長，在溫度為10、45 ℃時(shí)不生長；在400 mL/L甘露醇、山梨醇、馬尿酸鈉、甘油、海藻糖、蔗糖、果糖、七葉苷中生長；不能利用阿拉伯糖、菊糖、棉籽糖和鼠李糖。結(jié)果表明，分離株符合牛鏈球菌的生化特性。生化特性鑒定結(jié)果見表2。

表2 分離株的生化反應(yīng)結(jié)果

注：“+”為產(chǎn)酸不產(chǎn)氣/陽性；“-”為不產(chǎn)酸不產(chǎn)氣/陰性。

2.4 藥敏試驗(yàn)

對分離培養(yǎng)獲得的純化菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果見表3。

表3 分離株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論與結(jié)論

目前，能夠引起動(dòng)物腦炎的病原有細(xì)菌、病毒、真菌、立克次體、原蟲等。其中，細(xì)菌主要有肺炎鏈球菌、腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌、B族鏈球菌和奈瑟球菌等[3-5]。病毒主要有單純皰疹病毒、日本腦炎病毒、西尼羅腦炎病毒等約有100多種病毒可致人和動(dòng)物得腦炎[6]。根據(jù)離株的培養(yǎng)特性、染色特點(diǎn)、形態(tài)觀察及生化試驗(yàn)可知，導(dǎo)致此次犢牛腦炎的細(xì)菌為β-溶血性牛鏈球菌。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，分離株對青霉素、萬古霉素、阿奇霉素、阿莫西林、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、羅紅霉素敏感，對四環(huán)素、卡那霉素、慶大霉素耐受，說明該菌株具有多重耐藥性。鏈球菌是革蘭陽性菌，理論上很多藥物對其有療效。但近年來由于抗生素的濫用，如在動(dòng)物飼料中長期添加抗生素用于促進(jìn)生長及預(yù)防和治療疾病，發(fā)生疾病后未經(jīng)獸醫(yī)診斷就盲目大量使用多種抗生素等，不僅治療成本提高，而且產(chǎn)生了大量耐藥菌株，使得疾病難以控制。因此，牛場在防治鏈球菌病時(shí)，應(yīng)對菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，用2～3種敏感藥物按療程和足夠的劑量交替使用。

[1]東秀珠，蔡妙英. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M]. 北京：科學(xué)出版社，2001.

[2]王建永，張 磊，趙月蘭，等. 腹瀉犢牛病原分離鑒定及藥敏實(shí)驗(yàn)[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，31(5)：118-121.

[3]Metter K B，Lisbeth N P，Jens K M.Eight-plex PCR and liquidarray ditection of bacterial and viral pathogens in cerebrospinal fluid from patients with suspected memingitis[J]. J Clin Microbiol，2009，47(4)：908-913.

[4]趙戰(zhàn)峰，宋軍科，于三科. 奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，31(4)：113-115.

[5]王慧敏，高云英，田飛鵬. 腦膜炎球菌外膜蛋白NhhA的表達(dá)及免疫效果評(píng)價(jià)[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，31(12)：53-57.

[6]Ye C T，Abraham S，Wu H Q，et al. Silencing early viral replication in macrophages and denritic cells effectively suppresses flavivirus encephalitis[J]. PLoS One，2011，6(3)：1-7.