宋亞楠，安茜，岳敏，趙熙寧，劉寶玲，薛金愛，李潤(rùn)植

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，山西 太谷 030801)

ω-6脂肪酸去飽和酶(FAD2)是一種普遍定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜結(jié)合型酶蛋白[1]，能夠催化油酸(18∶1Δ8)在第12個(gè)C原子位置脫氫形成雙鍵進(jìn)而生成亞油酸(18∶2Δ9, 12)。該酶控制著植物細(xì)胞內(nèi)油酸、亞油酸及其它多不飽和脂肪酸的積累量。亞油酸(18∶2Δ9, 12)是人體必需的脂肪酸，能降低血液中膽固醇的含量，但其具有2個(gè)雙鍵，很容易氧化，使植物油產(chǎn)生酸敗，進(jìn)而影響人體健康。相反，單不飽和油酸(18∶1Δ9)氧化穩(wěn)定性比亞油酸高10倍[2]，同樣能顯著降低血液中的膽固醇含量。因此，培育對(duì)人體有益的富含油酸的植物油越來越受到人們的關(guān)注。現(xiàn)已在棉花[1,3]、玉米[4]、紫蘇[5]、油棕[6]、花生[7]和大豆[8,9]等多種植物中成功克隆并驗(yàn)證了FAD2基因的功能。通過反義RNA技術(shù)抑制大豆FAD2基因的表達(dá)，能顯著提高油酸的合成，培育獲得種子富含油酸的大豆種質(zhì)[10]。同樣，通過RNA i技術(shù)抑制棉花FAD2基因的表達(dá)，可使棉籽油酸的含量提升到77%，而亞油酸含量由60%降為4%[11]。研究表明，在高等植物細(xì)胞中，遺傳修飾其內(nèi)源FAD2基因表達(dá)水平可有效調(diào)控細(xì)胞中油酸及亞油酸的比例。

Chi等[12]已經(jīng)從低等植物萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)中成功克隆并鑒定了CrFAD2基因。Lu等[13]也已經(jīng)從小球藻(Chlorella vulgaris)中克隆了CvFAD2基因，通過酵母異源表達(dá)檢測(cè)到通常不存在于野生型酵母細(xì)胞的油酸(18∶2)的合成，驗(yàn)證了CvFAD2基因的功能。杜氏鹽藻(Dunaliella salina)是一種無細(xì)胞壁的單細(xì)胞真核綠藻，藻細(xì)胞中油脂含量可高達(dá)到36%～42%[14]，其脂肪酸組成包括飽和脂肪酸，以及油酸、亞油酸和亞麻酸等不飽和脂肪酸[15]，是食用和工業(yè)用(生物柴油及油脂化工品)油脂的珍貴資源。特別是鹽藻能在高鹽的水體中生長(zhǎng)，可低成本規(guī)模化養(yǎng)殖、且不易發(fā)生有害生物污染。養(yǎng)殖鹽藻日漸成為商業(yè)化生產(chǎn)高值油脂和鹽堿水體資源化利用的一條綠色可持續(xù)的路徑。然而，有關(guān)鹽藻油脂合成代謝及其調(diào)控分子機(jī)制還不清楚。

為此，本文選取參與控制單不飽和脂肪酸與多不飽和脂肪酸合成比例的FAD2(fatty acid desaturase 2)酶基因?yàn)榘袠?biāo)，以運(yùn)城鹽湖分離的富油鹽藻株系(YC-011)為試材，利用高保真PCR技術(shù)克隆鹽藻DsFAD2基因，并應(yīng)用生物信息學(xué)方法詳盡分析DsFAD2編碼蛋白的理化性質(zhì)、跨膜區(qū)域、3D高級(jí)結(jié)構(gòu)及氨基酸保守基序和系統(tǒng)進(jìn)化等特征，進(jìn)一步應(yīng)用qRT-PCR分析DsFAD2在缺N脅迫下的表達(dá)模式，解析其生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 生物材料

本實(shí)驗(yàn)室從運(yùn)城鹽湖分離純化獲得一株富油杜氏鹽藻株系(YC-011)，培養(yǎng)并保存于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)能源微藻種質(zhì)庫。使用DM培養(yǎng)基，在25 ℃，2 000 lx，12 h/12 h光照培養(yǎng)條件下培養(yǎng)杜氏鹽藻YC-011。

1.2 氮(N)脅迫處理

將杜氏鹽藻(YC-011)在DM培養(yǎng)基正常培養(yǎng)8 d后，通過8 000 r·min-1離心3 min收集藻細(xì)胞，并重新懸浮在不含N源的DM培養(yǎng)基中，缺N培養(yǎng)8 d。為了研究杜氏鹽藻DsFAD2在缺N脅迫下的轉(zhuǎn)錄水平，分別取在缺N培養(yǎng)基中培養(yǎng)1，2，4，8 d的藻細(xì)胞樣品提取總RNA。未缺N處理的藻細(xì)胞樣品在正常條件下培養(yǎng)1，2，4，8 d作為對(duì)照。

1.3 總RNA提取及cDNA合成

分別取不同處理下的鹽藻培養(yǎng)物，離心收集藻細(xì)胞。使用EASYspin植物RNA快速提取試劑盒提取藻細(xì)胞總RNA，用5X All-In-One RT Master Mix (with AccuRT Genomic DNA Removal Kit)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。

1.4 PCR克隆杜氏鹽藻FAD2編碼序列

依據(jù)已有鹽藻FAD2基因序列(Dusal.0482s00008.1)設(shè)計(jì)PCR引物：FAD2-F：AAAATGGGAGCAGGTGGACA；FAD2-R：ACAGAGGAGCATGACAACGA。以YC-011株系藻細(xì)胞的總RNA為模板，用高保真PCR擴(kuò)增DsFAD2編碼序列，測(cè)序獲得DsFAD2的cDNA序列，并推測(cè)其編碼蛋白序列。

1.5 qRT-PCR檢測(cè)DsFAD2在缺N脅迫下的表達(dá)

從NCBI上獲得內(nèi)參基因GAPDH(EU447774.1)，用Primer 3 Input(http://primer3.ut. ee/)在線網(wǎng)站設(shè)計(jì)Real-time PCR的引物：DsFAD2-F：5’-GTACTGGTTTTGGCAGGGTG-3’，DsFAD2-R：5’-CCACAGTGTCATTCAGCCAC-3’；GAPDH-F：5’-ACATGGTCAAGGTTG TTGCC-3’，GAPDH-R：5’-CAGGTGGTGATGGAAGAGGT-3’。使用EASY spin植物RNA快速提取試劑盒提取總RNA，通過5X All-In-One RT MasterMix (with AccuRT Genomic DNA Removal Kit)獲得cDNA。qRT-PCR 使用EvaGreen 2X qPCR Master Mix，用CFX96 Real-time PCR Detection System進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)，每個(gè)樣品重復(fù)3次。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。以內(nèi)參基因GAPDH為對(duì)照，通過Excel和SPASS處理相對(duì)表達(dá)量并繪制柱狀圖。

1.6 DsFAD2蛋白理化特性的生物信息學(xué)分析

利用ExPasy提供的ProtParam在線工具(http://web.expasy.org/protparam/)分析杜氏鹽藻DsFAD2蛋白的氨基酸組成、理論等電點(diǎn)和疏水指數(shù)等理化性質(zhì)。利用CBS Prediction Servers在線網(wǎng)站(http://www.cbs.dtu.dk/services/)的NetPhos工具分析該蛋白磷酸化位點(diǎn)；利用TMHMM Server工具來預(yù)測(cè)該蛋白的跨膜區(qū)域(http://www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM/)。利用HNN secondary structure prediction在線工具預(yù)測(cè)杜氏鹽藻DsFAD2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_hnn. html)；利用同源建模法，采用Intensive模式，使用Phyre2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/ phyre2/html/page.cgi?id=index)預(yù)測(cè)上述蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)。利用IBIVU Server(http://www.ibi. vu.nl/programs/pralinewww/)對(duì)杜氏鹽藻DsFAD2蛋白和其它5種不同物種的FAD2蛋白進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)。使用MEGA7.0軟件對(duì)杜氏鹽藻DsFAD2蛋白和另外19種不同物種的FAD2蛋白進(jìn)行ClustalW的多序列比對(duì)，采用鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,自舉檢驗(yàn)值設(shè)為1 000個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 運(yùn)城鹽藻株系(YC-011)DsFAD2基因編碼序列(ORF)的克隆

依據(jù)已知鹽藻FAD2序列設(shè)計(jì)引物，用YC-011總RNA制備的cDNA為模板，應(yīng)用高保真PCR克隆獲得YC-011鹽藻株系DsFAD2基因的編碼序列，測(cè)序結(jié)果證明，克隆到DsFAD2基因的完整ORF(1 143 bp)，推測(cè)的蛋白序列與參考序列完全一致(380aa)(圖3)。

2.2 杜氏鹽藻DsFAD2蛋白的結(jié)構(gòu)特征分析

2.2.1 杜氏鹽藻DsFAD2蛋白的理化性質(zhì)和磷酸化位點(diǎn)分析

本文以擬南芥AtFAD2為對(duì)照，對(duì)杜氏鹽藻DsFAD2酶蛋白理化性質(zhì)分析(表1)表明，DsFAD2的相對(duì)分子量為43.43 kDa，其中氨基酸含量最高的是Ala(10.3%)、次之為Val(8.9%)，含量較低的是Met(2.1%)和Cys(1.3%)。理論等電點(diǎn)為7.78，小于AtFAD2的pI值。DsFAD2不穩(wěn)定系數(shù)為42.17，高于AtFAD2(37.93)。DsFAD2蛋白平均親水性指數(shù)為-0.082，說明其親水性差，屬于疏水性蛋白。磷酸化預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)：DsFAD2絲氨酸激酶(Ser)的磷酸化位點(diǎn)最多，為15個(gè)，在N端分布比較緊密。絡(luò)氨酸激酶(Tyr)的磷酸化位點(diǎn)為4個(gè)，磷酸化最高得分小于其他兩種激酶(Ser和Thr)。16位的絲氨酸預(yù)測(cè)分值最高，為0.998，在此處磷酸化可能性最大。另外，絡(luò)氨酸激酶(Tyr)的磷酸化位點(diǎn)遠(yuǎn)少于AtFAD2(12個(gè))，且磷酸化最高得分也較小，預(yù)測(cè)在絡(luò)氨酸處磷酸化的能力較低。DsFAD2的總磷酸化位點(diǎn)數(shù)(27個(gè))明顯少于AtFAD2(40個(gè))?？赡茉谠孱愔写呋退嶙?yōu)閬営退岬倪^程僅需較少的磷酸化就可以完成。

2.2.2 杜氏鹽藻DsFAD2跨膜結(jié)構(gòu)

跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)DsFAD2酶蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上由內(nèi)到外有5個(gè)跨膜螺旋區(qū)，其對(duì)應(yīng)的跨膜位置為 i52-72o82-104i116-138o177-199i231-253o(如圖1：“o”代表膜外，“i”代表膜內(nèi))。與AtFAD2的跨膜區(qū)(o54-76i83-105o115-137i174-196o223-245i252-274o，6個(gè))相比，跨膜區(qū)數(shù)少一個(gè)。DsFAD2酶蛋白N端位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜內(nèi)側(cè)，C端處于細(xì)胞質(zhì)中，而AtFAD2酶蛋白N端、C端均暴露于細(xì)胞質(zhì)中。DsFAD2前5個(gè)跨膜區(qū)位置與AtFAD2非常相近。預(yù)測(cè)其在藻類中發(fā)生催化作用的路徑相似，但是跨膜方向相反，緊連第5個(gè)跨膜區(qū)的一段序列嵌入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中，可能與形成底物結(jié)合位點(diǎn)不同有關(guān)。

表1 DsFAD2和AtFAD2的理化性質(zhì)和磷酸化位點(diǎn)分析

Table1 Analysis on physical chemical properties and phosphorylation sites of DsFAD2 and AtFAD2

蛋白名稱Proteinname鹽藻FAD2DsFAD2擬南芥FAD2AtFAD2蛋白長(zhǎng)度/aa380383相對(duì)分子量/kD43.4344.05理論等電點(diǎn)/pI7.788.39不穩(wěn)定系數(shù)42.1737.93脂肪系數(shù)85.4783.52總平均親水性指數(shù)-0.082-0.094Ser磷酸化位點(diǎn)數(shù)1518Thr磷酸化位點(diǎn)數(shù)810Tyr磷酸化位點(diǎn)數(shù)412磷酸化位點(diǎn)總數(shù)2740

2.3 DsFAD2酶蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)分析

對(duì)DsFAD2蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果(圖2)表明，該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中主要為α螺旋和無規(guī)則卷曲，比例分別為46.84%和42.89%。β片層所占比例最少，為10.26%。與AtFAD2的結(jié)構(gòu)(α螺旋：43.60%，無規(guī)則卷曲：46.48%)相比，各成分所占比例相差不大。α螺旋所在位置(51～72,81～105, 182～199,226～244,255～273)與上述跨膜區(qū)預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致。用同源建模的方法預(yù)測(cè)杜氏鹽藻DsFAD2酶蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)顯示，DsFAD2預(yù)測(cè)的氨基酸范圍為71%(估測(cè)率大于90%)，與AtFAD2結(jié)構(gòu)相似。

圖1 DsFAD2和AtFAD2的蛋白跨膜螺旋區(qū)預(yù)測(cè)Fig.1 Prediction of protein transmembrane helix region of DsFAD2 and AtFAD2

圖2 DsFAD2和AtFAD2的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.2 The third structure Prediction of DsFAD2 and AtFAD2

2.4 杜氏鹽藻DsFAD2蛋白的氨基酸序列分析及系統(tǒng)發(fā)育分析

氨基酸序列比對(duì)結(jié)果表明，杜氏鹽藻DsFAD2酶蛋白也具有其他物種FAD2酶蛋白所具有的3個(gè)保守的組氨酸富集區(qū)，分別為HisboxⅠ：WVIAHECGH，HisboxⅡ：SHRRHH和HisboxⅢ：DTHVAHHLFS(圖3)，分別位于93～111、142～147和315～321位氨基酸，能形成與鐵離子結(jié)合的酶活性催化中心，且在279(Ser)位和315(Thr)位處有2個(gè)磷酸化位點(diǎn)，可能調(diào)控該蛋白的催化活性。另外，杜氏鹽藻DsFAD2沒有檢測(cè)到KKXX-like motif內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)，但是在序列C端發(fā)現(xiàn)一段富含芳香族氨基酸的保守序列“VYWY”(378～381位氨基酸)。已有研究指出，C端富含芳香族氨基酸保守序列能將FAD2酶蛋白滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中[16]。因此，DsFAD2的C端保守序列“VYWY”具有類似內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)的作用。綜合分析說明DsFAD2酶蛋白為膜結(jié)合蛋白，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。

圖3 各物種FAD2蛋白的氨基酸序列比對(duì)Fig.3 The aligment of FAD2 proteins of different species

利用MEGA 7.0軟件對(duì)YC-011杜氏鹽藻株系DsFAD2蛋白和已報(bào)道的17個(gè)物種的FAD2蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4)。結(jié)果表明，進(jìn)化樹中所采用的18個(gè)物種的FAD2蛋白可分為陸生植物和藻類兩大支。杜氏鹽藻與亞麻薺等陸生植物的FAD2蛋白親緣關(guān)系比較遠(yuǎn)，與萊茵衣藻和團(tuán)藻的親緣關(guān)系較近。

圖4 各物種FAD2蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.4 Phylogenetic analysis of FAD2 proteins of different species 注：各物種FAD2蛋白的序列登錄號(hào)：擬南芥AtFAD2(NP_187819.1)，萊茵衣藻CrFAD2(XP_001691669.1)，團(tuán)藻VcFAD2(XP_002955859.1)，亞麻薺CsaFAD2(ADU18247.1)，大豆GmFAD2(BAD89862.1)，小球藻CvFAD2(ACF98528.1)，芍藥PlFAD2(AKE44629.1)，亞麻L(zhǎng)uFAD2(ACF49507.1)，克萊門柚CcFAD2(XP_006445919)，橙子CsiFAD2(XP_006492662)，甜瓜CmFAD2(XP_008443062.1)，芝麻SiFAD2(AAF80560)，葡萄VvFAD2(XP_002285640)，陸地棉GhFAD2(AAL37484.1)，甘藍(lán)型芥菜BniFAD2(ADJ58018.1)，缺刻葉球藻LiFAD2(AEU04701.1)，甘藍(lán)型油菜BnaFAD2(ACP39505.1)Note：Accession number of various FAD2 protein sequences:Arabidopsis thaliana AtFAD2(NP_187819.1)，Chlamydomonas reinhardtii CrFAD2(XP_001691669.1)，Volvox carteri f. Nagariensis VcFAD2(XP_002955859.1)，Camelina sativa CsaFAD2(ADU18247.1)，Glycine max GmFAD2(BAD89862.1)，Chlorella vulgaris CvFAD2(ACF98528.1)，Paeonia lactiflora PlFAD2(AKE44629.1)，Linum usitatissimum LuFAD2(ACF49507.1)，Citrus clementina CcFAD2(XP_006445919)，Citrus sinensis CsiFAD2(XP_006492662)，Cucumis melo CmFAD2(XP_008443062.1)，Sesamum indicum SiFAD2(AAF80560)，Vitis vinifera VvFAD2(XP_002285640)，Gossypium hirsutum GhFAD2(AAL37484.1)，Brassica nigra BniFAD2(ADJ58018.1)，Lobosphaera incisa LiFAD2(AEU04701.1)，Brassica napus BnaFAD2(ACP39505.1)

2.5 缺氮脅迫下杜氏鹽藻DsFAD2的表達(dá)分析

以正常培養(yǎng)的杜氏鹽藻(YC-011)樣品作為對(duì)照，通過qRT-PCR分析DsFAD2的mRNA相對(duì)表達(dá)豐度(圖5)。結(jié)果表明，在正常和缺N培養(yǎng)條件下，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，DsFAD2的表達(dá)量均有明顯變化。在正常培養(yǎng)條件下第2天時(shí)，DsFAD2表達(dá)量上升，在第4天時(shí)開始下降，到第8天時(shí)其表達(dá)量為第1天時(shí)的67%。在缺N培養(yǎng)條件下，第1天時(shí)與對(duì)照相比，DsFAD2表達(dá)減低16%，從第2天開始，DsFAD2表達(dá)逐漸增高，到第8天時(shí)其表達(dá)量為第1天時(shí)的2.2倍，是對(duì)照的2.8倍。由此可知，缺N脅迫顯著誘導(dǎo)DsFAD2基因的上調(diào)表達(dá)。

3 討論

ω-6脂肪酸去飽和酶2(FAD2)催化油酸形成亞油酸，是多不飽和脂肪酸合成的限速酶和決定細(xì)胞脂肪酸組成的一個(gè)關(guān)鍵因素。因此，通過調(diào)控FAD2基因的表達(dá)來調(diào)控細(xì)胞中飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的比例，能改善油脂品質(zhì)，滿足人類對(duì)油脂的各種需求。鑒定杜氏鹽藻DsFAD2基因和表達(dá)模式，對(duì)探究鹽藻油脂合成積累及其調(diào)控的分子機(jī)制具有重要意義，也能為后續(xù)進(jìn)行敲除或RNAi干擾該基因表達(dá)，以期改變其脂肪酸組成，進(jìn)而獲得高油酸杜氏鹽藻新種質(zhì)提供科學(xué)依據(jù)。

本文以本實(shí)驗(yàn)室分離獲得富油杜氏鹽藻YC-011株系為試材，克隆到DsFAD2完整的ORF序列。生物信息學(xué)分析表明，杜氏鹽藻DsFAD2為膜結(jié)合蛋白，其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α螺旋和無規(guī)則卷曲構(gòu)成，這與跨膜區(qū)預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致，也體現(xiàn)在三級(jí)結(jié)構(gòu)中。FAD2酶蛋白不同位置的跨膜螺旋區(qū)是實(shí)現(xiàn)催化作用的結(jié)構(gòu)保障[17]，DsFAD2酶蛋白的后四個(gè)跨膜螺旋區(qū)位于脂肪酸去飽和酶結(jié)構(gòu)域所在位置，為形成特定的底物結(jié)合位點(diǎn)提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。不同物種FAD2酶蛋白跨膜區(qū)數(shù)目的不同對(duì)酶活性的影響還未有相關(guān)研究報(bào)道，可能由遺傳背景決定。DsFAD2酶蛋白和其他物種FAD2一樣都含有3個(gè)組氨酸富集區(qū)，能夠形成DsFAD2酶蛋白活性中心，以及相應(yīng)鐵離子的結(jié)合位點(diǎn)。另外，杜氏鹽藻DsFAD2有一段富含芳香族氨基酸的保守序列“VYWY”，將該蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，從而推測(cè)有利于催化作用的高效進(jìn)行。

qRT-PCR分析表明，DsFAD2的表達(dá)量在缺N脅迫下顯著上調(diào)表達(dá)，預(yù)示著DsFAD2參與藻細(xì)胞N脅迫響應(yīng)。前期研究發(fā)現(xiàn)，缺N脅迫培養(yǎng)明顯促進(jìn)藻細(xì)胞油脂積累，在脅迫8 d時(shí)，藻細(xì)胞油脂含量為對(duì)未脅迫對(duì)照的2倍多，且亞油酸(C18∶2)含量上升為對(duì)照的3倍多，而飽和脂肪酸即棕櫚酸(C16∶0)和油酸(C18∶0)含量下降。顯然，DsFAD2的上升表達(dá)導(dǎo)致藻細(xì)胞脂肪酸不飽和度提高，增加了細(xì)胞生物膜的流動(dòng)性，從而增強(qiáng)藻細(xì)胞的抗逆性。目前，對(duì)杜氏鹽藻DsFAD2的研究尚淺，未來需深入解析鹽藻響應(yīng)N脅迫的信號(hào)分子以及激活DsFAD2表達(dá)的分子網(wǎng)絡(luò)。

4 結(jié)論

本研究成功克隆杜氏鹽藻(YC-011)DsFAD2基因，生物信息學(xué)分析表明：DsFAD2蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，有5個(gè)跨膜區(qū)、3個(gè)組氨酸保守區(qū)和芳香族氨基酸序列，與萊茵衣藻、團(tuán)藻親緣關(guān)系最近。另外，DsFAD2參與杜氏鹽藻N脅迫響應(yīng)，促進(jìn)油脂的合成和積累。本研究不僅為進(jìn)一步解析N脅迫條件下藻細(xì)胞油脂富集及響應(yīng)分子機(jī)制提供了科學(xué)參考，還為改良YC-011鹽藻油脂品質(zhì)、培育有不同用途的富油YC-011株系，以及建立高效規(guī)?；囵B(yǎng)杜氏鹽藻技術(shù)體系，生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)高值油脂提供了科學(xué)依據(jù)。

[1] Zhang D,Pirtle IL,Park SJ,et al.Identification and expression of a new delta-12 fatty acid desaturase (FAD2-4) gene in upland cotton and its functional expression in yeast andArabidopsisthalianaplants [J].Plant Physiology and Biochemistry,2009,47(6)：462-471.

[2] O’keefe S F,Wiley V A,Knauft D A.Comparison of oxidative stability of high-and normal-oleic peanut oils[J].Journal of the American Oil Chemists’ Society,1993,70(5)：489-492.

[3] Liu W,Li W,He QL,et al.Characterization of 19 genes encoding membrane-bound fatty acid desaturases and their expression profiles inGossypiumraimondiiunder low temperature [J].Plos One,2015,10(4):e0123281

[4] Beló A,Zheng P,Luck S,et al.Whole genome scan detects an allelic variant of fad2 associated with increased oleic acid levels in maize [J].Molecular Genetics and Genomics,2008,279(1):1-10.

[5] Lee,Lee Y,Kim EH,et al.Functional identification of oleate 12-desaturase and ω-3 fatty acid desaturase genes fromPerillafrutescensvar.frutescens[J].Plant Cell Reports,2016,35(12):2523-2537.

[6] Sun R,Gao L,Yu X,et al.Identification of a Δ12 fatty acid desaturase from oil palm (ElaeisguineensisJacq.) involved in the biosynthesis of linoleic acid by heterologous expression inSaccharomycescerevisiae[J].Gene,2016,591(1):21-26.

[7] Wang Y,Zhang X,Zhao Y,et al.Insights into the novel members of the FAD2 gene family involved in high-oleate fluxes in peanut [J].Genome,2015,58(8):375-383.

[8] Li L,Wang X,Gai J,et al.Isolation and characterization of a seed-specific isoform of microsomal omega-6 fatty acid desaturase gene (FAD2-1B) from soybean [J].DNA Sequence,2008,19(1):28-36.

[9] Pham AT,Shannon JG,Bilyeu KD.Combinations of mutant FAD2 and FAD3 genes to produce high oleic acid and low linolenic acid soybean oil [J].Theoretical and applied genetics,2012,125(3):503-515.

[10] Buhr T,Sato S,Ebrahim F,et al.Ribozyme termination of RNA transcripts down-regulate seed fatty acid genes in transgenic soybean [J].Plant Journal,2002,30(2):155-163.

[11] Menard GN,Moreno JM,Bryant FM,et al.Genome Wide Analysis of Fatty Acid Desaturation and Its Response to Temperature [J].Plant Physiology,2017,173(3):1594-1605.

[12] Chi X,Zhang X,Guan X,et al.Fatty acid biosynthesis in eukaryotic photosynthetic microalgae：identification of a microsomal delta 12 desaturase in Chlamydomonas reinhardtii[J].Journal of Microbiology.2008,46(2):189-201.

[13] Lu Y,Chi X,Yang Q,et al.Molecular cloning and stress-dependent expression of a gene encoding Delta(12)-fatty acid desaturase in the Antarctic microalga Chlorella vulgaris NJ-7[J].Extremophiles，2009,13(6):875-884.

[14] Liang MH,Qv XY,Jin HH,et al.Characterization and expression of AMP-forming Acetyl-CoA Synthetase fromDunaliellatertiolectaand its response to nitrogen starvation stress[J].Scientific reports,2016,30(6):23445.

[15] 孫協(xié)軍,劉淼,李秀霞,等.鹽藻油微波輔助提取工藝優(yōu)化及脂肪酸組成分析[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào),2016,31(1):70-75.

[16] McCartney AW,Dyer JM,Kim PK,et al.Membrane-bound fatty acid desaturases are inserted co-translationally into the ER and contain different ER retrieval motifs at their carboxy termini [J].Plant Journal,2004,37(2)：156-173.

[17] Minto RE,Gibbons WJ Jr,Cardon TB,et al.Synthesis and conformational studies of a transmembrane domain from a diverged microsomal Delta(12)-desaturase [J].Analytical biochemistry,2002,308(1):134-140.