雷果平 王福 楊楸楠 陳仕偉

【摘要】目的：探索一種黃曲霉DNA快速提取、產(chǎn)毒菌株快速鑒別的檢測方法。方法：首次比較考察了CTAB法、試劑盒法與改良堿裂解法對黃曲霉菌株DNA提取的優(yōu)缺點(diǎn)，并采用特異性PCR對黃曲霉菌株進(jìn)行產(chǎn)毒陰陽性鑒別。結(jié)果：改良堿裂解法可在10min內(nèi)提取黃曲霉DNA，黃曲霉產(chǎn)毒菌株特異性PCR結(jié)果顯陽性，其他菌株顯陰性。結(jié)論：改良堿裂解法可快速提取黃曲霉DNA，特異性PCR可對黃曲霉產(chǎn)毒菌株進(jìn)行快速分子鑒定。

【關(guān)鍵詞】黃曲霉;DNA提取;產(chǎn)毒菌株;鑒定

黃曲霉（Aspergillus flavus）是一種腐生型好氧真菌，其次級代謝產(chǎn)生的黃曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）是一種強(qiáng)致癌性劇毒物質(zhì)，引起世界廣泛關(guān)注。對黃曲霉菌DNA的高效提取及菌株產(chǎn)毒陰陽性的快速鑒別研究對保障食品及中藥材的安全具有重要意義。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

黃曲霉產(chǎn)毒菌株（3.4408）與兩株黃曲霉非產(chǎn)毒菌株（3.0321、3.2572）采購于中國科學(xué)院微生物菌株保藏中心，其他黃曲霉、黑曲霉、普通青霉、朱黃青霉菌株均分離于中藥材陳皮表面。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

氫氧化鈉，無水乙醇，氯化鈉，異戊醇，苯酚，聚乙烯毗咯烷酮，DL2000Maker，瓊脂糖，苯酚，無水乙醇，氯仿，異戊醇，PVP，Tris-HCL（JieHui Biotech Co.，China），RNA酶（Tiangen Biotech Co.，China），植物DNA提取試劑盒（TiangenBiotech Co.，China），2×Taq PCRMasterMix（Tiangen Biotech Co.，China）;引物由上海生工（SangonCo.，China）合成。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

Retsch MM400球磨儀（德國萊馳公司）;PTC200PCR儀（美國BIO-Rad公司）;Ge1Dox XR凝膠成像系統(tǒng)（美國BIO-Rad公司）;DYI-8C電泳儀（北京六一儀器廠）：KRQ-300P人工氣候箱（重慶英博試驗(yàn)儀器）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 DNA提取

2.1.1 CTAB法

取少許新鮮菌體（約20mg），加入液氮進(jìn)行研磨，然后加入3ml 2%CTAB（加PVP），裝管;采用65 ℃水浴，時間為45min，采用13000r/min離心10min;取上清（水相）于一新離心管中，加等體積的酚：氯仿：異戊醇（25：24：1），12000r/min離心10min;取上清，加等體積的氯仿：異戊醇（24：1），12000r/min離心10min;取上清，加2L的無水乙醇和NaCl溶液，-20℃沉淀30min，12000r/min離心20min;收集沉淀，采用75酒精進(jìn)行沖洗，利用超凈臺進(jìn)行真空干燥;100μlTE溶解DNA，-20℃進(jìn)保存?zhèn)溆?。加?μl的RNA酶，37℃水浴1h;加入400μl氯仿：異戊醇（24：1），12000r/min離心10min，重復(fù)2次。

2.1.2 試劑盒法（該方法按試劑盒操作說明方法進(jìn)行）。

2.1.3 改良堿裂解法

取5mg菌體，加入80μl0.5mol/LNaOH，渦旋30s，加入160μl0.1mol/LTris-HC1中和，離心后取上清作模板備用。

2.2 ITS序列的PCR擴(kuò)增與電泳

ITS序列擴(kuò)增采用DNA條形碼通用引物ITS1/ITS4。PCR的反應(yīng)條件以及擴(kuò)增的程序均參考夏等的研究。PCR反應(yīng)后取5μL反應(yīng)液經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

3 結(jié)果

3.1 種黃曲霉DNA提取方法優(yōu)缺點(diǎn)對比結(jié)果

從所用時間、試劑數(shù)量、儀器依賴度、有無毒性及耗費(fèi)成本多方面比較CTAB法、試劑盒法及其改良堿裂解法提取黃曲霉DNA的優(yōu)缺點(diǎn)，得出：改良堿裂解法用時最短，在耗費(fèi)成本等方面均優(yōu)于其他提取方法。

3.2 特異性PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

黃曲霉產(chǎn)毒菌株（3.4408）有一條明顯的PCR擴(kuò)增條帶，而黃曲霉非產(chǎn)毒菌株（3.0321、3.2572）、黃曲霉菌株CPdI與CPd2、桔青素、黑曲霉、普通青霉以及朱黃青霉都沒有條帶產(chǎn)生。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，其經(jīng)一部地驗(yàn)證了黃曲霉菌株（3.4408）為產(chǎn)毒菌株，而從中藥陳皮分離鑒定出的二株黃曲霉菌株及其他三種真菌均不具有產(chǎn)生毒素的能力，為產(chǎn)毒陰性菌株。

4 討論

PCR擴(kuò)增技術(shù)被廣泛應(yīng)用于多基原中藥材的鑒別，具有靈敏、特異及快速的優(yōu)點(diǎn)。本研究根據(jù)黃曲霉產(chǎn)毒菌株關(guān)鍵基因aflR設(shè)計(jì)一對引物，通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果能夠看出該方法可以對黃曲霉產(chǎn)毒菌株進(jìn)行有效鑒別。另外，在實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)黃曲霉產(chǎn)毒菌株在其生長后期會產(chǎn)生大量的黑色菌核，需要對其進(jìn)行充分的重視。

同時在本研究之中，嘗試通過多重PCR以及DNA條形碼技術(shù)來對黃曲霉產(chǎn)毒菌株開展鑒別，通過實(shí)驗(yàn)?zāi)軌虬l(fā)現(xiàn)多重PCR技術(shù)對產(chǎn)毒和非產(chǎn)毒菌株可以進(jìn)行有效地鑒別，但PCR結(jié)果容易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，很容易出現(xiàn)假陽性的情況;在采用DNA條形碼技術(shù)來鑒別黃曲霉產(chǎn)毒菌株和非產(chǎn)毒菌株的過程之中發(fā)現(xiàn)，黃曲霉產(chǎn)毒菌株和非產(chǎn)毒菌株在ITS序列上存在有序列差異。

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