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      溪黃草對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響

      2018-03-15 01:06:38廖長(zhǎng)秀黎為能
      重慶醫(yī)學(xué) 2018年6期
      關(guān)鍵詞:黃草提取物肝癌

      羅 瑩,廖長(zhǎng)秀,賀 珊,賴 術(shù),黎為能

      (1.右江民族醫(yī)學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心,廣西百色 533000;2.右江民族醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室,廣西百色 533000;3.右江流域特色民族藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西百色 533000)

      原發(fā)性肝癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一,每年新發(fā)病例超過50萬人,且其發(fā)病率仍不斷增長(zhǎng)。中藥在控制肝癌病情發(fā)展、改善癥狀體征及提高生存質(zhì)量等方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。中藥溪黃草為民間常用草藥,主要用于治療急性黃疸型肝炎、急性膽囊炎、濕熱痢疾、腸炎、跌打瘀腫和養(yǎng)生保健等?,F(xiàn)代藥理學(xué)研究溪黃草具有護(hù)肝利膽和抗腫瘤作用,作為多種抗肝癌復(fù)方組分用于肝癌的治療,也有研究報(bào)道溪黃草單方對(duì)肝癌細(xì)胞增殖有抑制作用,但其具體機(jī)制尚不清楚[1-2]。本文利用表達(dá)譜芯片技術(shù),從系統(tǒng)藥理學(xué)角度研究溪黃草水提取物對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2相關(guān)基因的影響,以探討溪黃草抗肝癌的可能機(jī)制。

      1 材料與方法

      1.1材料 人肝癌HepG2購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所,胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司,溪黃草購(gòu)自廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,由右江民族醫(yī)學(xué)院覃道光副教授鑒定為溪黃草全株,Trizol為美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品,總RNA提取試劑盒為美國(guó)Zymo Research公司產(chǎn)品、FastQuant RT Kit(With gDNase)、SuperReal熒光定量預(yù)混試劑增強(qiáng)版(SYBR Green)購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,DUSP1兔單克隆抗體購(gòu)于英國(guó)Abcam公司,GAPDH鼠單克隆抗體、辣根(HRP)標(biāo)記羊抗兔IgG抗體、辣根(HRP)標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體為中杉金橋公司產(chǎn)品,其他Western blot電泳和轉(zhuǎn)膜及封閉試劑購(gòu)于碧云天生物技術(shù)公司。

      表1 DUSP1、IGFBP1、FXR和ALDH8A1引物

      1.2方法

      1.2.1溪黃草水提取物的制備 取溪黃草全株適量,加10倍量的水,煎煮2次,每次1 h,合并濾液,濃縮,經(jīng)冷凍干燥機(jī)制備成溪黃草水提取物凍干粉,-20 ℃密閉保存。臨用前用PBS溶解,高壓蒸汽滅菌,0.25 μm無菌濾器過濾后用完全培養(yǎng)基稀釋20倍(經(jīng)MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)含該濃度的PBS對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無明顯影響),配制成終濃度為9.54 mg/mL的溪黃草水提取物。

      1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)及處理 HepG2細(xì)胞含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),置于37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),細(xì)胞密度為80%~90%時(shí)可進(jìn)行傳代,2~3 d傳代1次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,胰酶消化成單細(xì)胞懸液,調(diào)整至合適的細(xì)胞密度,分別接種至25 cm2培養(yǎng)瓶和6孔板,實(shí)驗(yàn)分為2組:溪黃草水提取物組和陰性對(duì)照組(加含等量PBS的完全培養(yǎng)基)。細(xì)胞接種24 h后實(shí)驗(yàn)組分別加入溪黃草水提取物終濃度是9.54 mg/mL的完全培養(yǎng)基,對(duì)照組加等量培養(yǎng)基,作用24 h后,25 cm2培養(yǎng)瓶加入1 mL Trizol,送至上海卓立生物科技有限公司進(jìn)行表達(dá)譜芯片檢測(cè)。6孔板細(xì)胞用總RNA提取試劑盒提取RNA。

      1.2.3表達(dá)譜芯片研究 由上海卓立生物科技有限公司經(jīng)RNA提取、質(zhì)量鑒定合格后,與HOA 7.1版本的芯片進(jìn)行雜交,Cy5標(biāo)記aRNA,雜交程序?yàn)镺neArray Plus,Agilent 0.1 XDR 程序掃描,分析28 266個(gè)基因的變化。

      1.2.4RT-PCR驗(yàn)證表達(dá)芯片的結(jié)果 6孔板細(xì)胞(每組重復(fù)3個(gè)復(fù)孔)提取細(xì)胞總RNA,用紫外分光光度法檢測(cè)總RNA純度和濃度,取1 μg RNA按試劑盒說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,取合成的cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR,引物由Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì),引物序列、產(chǎn)物大小見表1。反應(yīng)體系按試劑盒說明,GAPDH、DUSP1和IGFBP1反應(yīng)條件為:預(yù)變性95 ℃ 15 min;變性95 ℃ 10 s,退火/延伸60 ℃ 20 s,共40個(gè)循環(huán)(Roche Lightcycler96熒光定量PCR儀擴(kuò)增);ALDH8A1和FXR反應(yīng)條件為:預(yù)變性95 ℃ 15 min;變性95 ℃ 10 s,退火60 ℃ 20 s,延伸72 ℃ 20 s,共40個(gè)循環(huán)(Bio-rad IQ5熒光定量PCR儀擴(kuò)增),結(jié)果分析采用2-△△Ct法分析。

      1.2.5Western blot驗(yàn)證表達(dá)芯片的結(jié)果 6孔板細(xì)胞(每組重復(fù)3個(gè)復(fù)孔)提取細(xì)胞總蛋白,用BCA法檢測(cè)總蛋白濃度,取15 μg 蛋白與6×十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上樣緩沖液按5∶1比例混勻煮沸變性5 min,SDS-PAGE電泳,濕法轉(zhuǎn)膜,5% BSA封閉2 h,一抗4 ℃孵育過夜、洗膜,二抗室溫孵育2 h、洗膜,化學(xué)發(fā)光法顯色,膠片曝光適當(dāng)時(shí)間,經(jīng)顯影、定影后,掃描后用Image J軟件讀取各組條帶灰度值。

      2 結(jié) 果

      2.1相差顯微鏡觀察溪黃草水提取物對(duì)HepG2細(xì)胞的影響 相差顯微鏡下觀察,溪黃草水提取物9.54 mg/mL處理24 h后,細(xì)胞形態(tài)皺縮,細(xì)胞數(shù)量明顯減少,見圖1。

      A:陰性對(duì)照組;B:溪黃草水提取物組(9.54 mg/mL)

      圖1相差顯微鏡觀察溪黃草水提取物對(duì)HepG2細(xì)胞的影響(×400)

      2.2表達(dá)譜芯片觀察溪黃草水提取物對(duì)HepG2基因的影響 溪黃草水提取物(9.54 mg/mL)作用24 h后264個(gè)基因上升2倍以上,194個(gè)基因下降2倍以上。其中增加和下降至對(duì)照組5倍以上的基因見表2。

      2.3表達(dá)譜芯片分析溪黃草水提取物對(duì)HepG2功能的影響 基因本體(GO)分析發(fā)現(xiàn)溪黃草主要影響24個(gè)HepG2分子功能、167個(gè)生物進(jìn)程通路和9個(gè)細(xì)胞組成。溪黃草處理后主要的GO分析變化的通路見表3。KEGG分析溪黃草主要影響7個(gè)HepG2信號(hào)通路,見表4。

      表2 溪黃草水提取物(9.54 mg/mL)處理肝癌HepG2細(xì)胞24 h后變化達(dá)5倍以上的基因

      續(xù)表2 溪黃草水提取物(9.54 mg/mL)處理肝癌HepG2細(xì)胞24 h后變化達(dá)5倍以上的基因

      表3 溪黃草水提取物影響HepG2的表達(dá)譜芯片GO分析結(jié)果

      表4 KEGG分析溪黃草改變HepG2的信號(hào)通路

      2.4RT-PCR驗(yàn)證部分芯片結(jié)果 將溪黃草水提取物處理的HepG2提取總RNA,實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)DUSP1、IGFBP1、ALDH8A1和FXR(NR1H4)表達(dá)發(fā)現(xiàn),與陰性對(duì)照組相比,溪黃草水提取物處理后可明顯增加DUSP1和IGFBP1的mRNA表達(dá),降低ALDH8A1和FXR的mRNA表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),與芯片結(jié)果基本一致。

      2.5Western blot驗(yàn)證部分芯片結(jié)果 將溪黃草水提取物處理的HepG2提取總蛋白,Western blot檢測(cè)DUSP1蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn),與陰性對(duì)照組相比(蛋白條帶灰度值DUSP1/GAPDH為1.15±0.19),溪黃草水提取物處理后(蛋白條帶灰度值DUSP1/GAPDH為2.87±0.35)可明顯增加DUSP1蛋白表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見圖2,與芯片結(jié)果一致(溪黃草水提取物處理后DUSP1 mRNA表達(dá)增加為陰性對(duì)照組的2.18倍)。

      表5 溪黃草水提取物對(duì)HepG2中DUSP1、IGFBP1、FXR和ALDH8A1 mRNA表達(dá)的影響

      *:P<0.01,與陰性對(duì)照組比較;芯片結(jié)果中倍數(shù)值是指溪黃草水提取組/陰性對(duì)照組

      圖2 Western blot檢測(cè)溪黃草水提取物對(duì)HepG2細(xì)胞DUSP1蛋白表達(dá)的影響

      3 討 論

      中藥治療疾病具有多組分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。本研究采用表達(dá)譜芯片技術(shù)研究了治療肝病的經(jīng)典中藥溪黃草對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞的影響,發(fā)現(xiàn)溪黃草水提取物可改變肝癌HepG2細(xì)胞458個(gè)基因的表達(dá),并影響多個(gè)分子功能、生物進(jìn)程、細(xì)胞組分和相關(guān)的信號(hào)通路。

      本研究發(fā)現(xiàn)溪黃草水提取物處理后促進(jìn)細(xì)胞增殖的細(xì)胞周期蛋白D(cyclin D1,CCND1)、細(xì)胞周期蛋白E(cyclin E1,CCNE1)、S期激酶相關(guān)蛋白2(S-phase kinase-associated protein 2,SKPZ2)[3]及起始識(shí)別復(fù)合物1(origin recognition complex subunit 1,ORC1)[4]均明顯降低,而抑制細(xì)胞增殖的細(xì)胞周期依賴性激酶抑制因子CDKN1A(cyclin-dependent kinase inhibitor 1A,p21)及CDKN2B(cyclin-dependent kinase inhibitor 2B,p15)則明顯升高,表明溪黃草可通過多種調(diào)控細(xì)胞周期的基因和蛋白抑制細(xì)胞增殖。

      微小染色體維持蛋白(minichromosome maintenance proteins,MCM)是真核細(xì)胞DNA復(fù)制準(zhǔn)許因子中的一個(gè)重要成員,可啟動(dòng)和參與DNA復(fù)制,對(duì)細(xì)胞DNA復(fù)制和周期具有調(diào)控作用[5]。其家族主要有MCM2~MCM7,已有研究表明MCM2、MCM3、MCM6、MCM7等在肝癌組織或肝癌細(xì)胞中異常表達(dá),RNA干擾降低MCM7的表達(dá)可使肝癌細(xì)胞增殖減少、凋亡增多,細(xì)胞周期S期縮短,裸鼠移植瘤生長(zhǎng)減慢[6-9]。本研究發(fā)現(xiàn)溪黃草水提取物處理的肝癌HepG2細(xì)胞MCM2、MCM3、MCM4、MCM5、MCM7均表達(dá)明顯降低,分別降至陰性對(duì)照組的0.35、0.32、0.41、0.39和0.40倍,提示溪黃草可能通過抑制MCM家族表達(dá),進(jìn)一步抑制肝癌細(xì)胞增殖及使其更多處于靜止期,并促進(jìn)其凋亡。

      本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)溪黃草水提取物處理HepG2細(xì)胞胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白超家族(insulin-like growth factor binding protein superfamily,IGFBPs)中IGFBP1、IGFBP3、IGFBP4、IGFBP6、IGFBP7、CYR61均明顯增加,分別增加至對(duì)照組的6.40、8.84、2.06、2.80、2.02和3.09倍,其中IGFBP1 mRNA表達(dá)已通過RT-PCR驗(yàn)證與芯片結(jié)果一致。已知胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin-like growth factor,IGF)與胰島素結(jié)構(gòu)相似,是具有促進(jìn)物質(zhì)代謝、降低血糖、促進(jìn)細(xì)胞分裂等多種功能的細(xì)胞增殖調(diào)控因子。IGFBPs可與其結(jié)合,結(jié)合后IGF作用減弱[10]。有研究報(bào)道IGFBP1和IGFBP3在肝癌組織或肝癌患者血清均低于正常水平,其與肝癌的預(yù)后呈正相關(guān)[11-12]。也有研究報(bào)道IGFBP3可通過非IGF途徑抑制腫瘤細(xì)胞增殖,促進(jìn)其凋亡[13],提示IGFBPs可能參與肝癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后。本研究結(jié)果表明溪黃草能提高部分IGFBPs表達(dá),通過IGF和非IGF途徑抑制肝癌細(xì)胞增殖,促進(jìn)其凋亡。

      已知MAPK(mitogen-activated protein kinase)是細(xì)胞內(nèi)一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,可將細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞外,參與細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和凋亡及血管的生成等[14]。目前已有研究表明MAPK相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(ERK1/2、p38、JNK和ERK5)通過調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲及轉(zhuǎn)移[15-16],在肝癌的發(fā)生過程中起著重要的調(diào)控作用,成為肝癌防治的重要作用靶點(diǎn)。而雙特異性磷酸酶(dual-specificity protein phosphatases,DUSPs)則可使MAPK去磷酸化,而抑制其活性,進(jìn)一步調(diào)控肝癌的發(fā)生、發(fā)展[17]。目前已有研究證實(shí),DUSP1在抑制肝癌發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用,它的表達(dá)與ERK的表達(dá)呈負(fù)相關(guān),與肝癌細(xì)胞增殖指數(shù),細(xì)胞的凋亡和存活率,以及微血管密度緊密相關(guān)[18]??赏ㄟ^調(diào)控 p-38/MAPK磷酸化增強(qiáng)p-53的磷酸化水平,誘導(dǎo)其下游靶基因p21和p27的表達(dá),調(diào)控細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡[19]。研究表明DUSP5同家族中的其他成員一樣,通過調(diào)控MAPK信號(hào)通路,調(diào)控多種腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移等過程,與腫瘤的發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)[20-21]。但是對(duì)肝癌細(xì)胞的影響方面尚未見有相關(guān)研究。本研究發(fā)現(xiàn)溪黃草水提取物處理的肝癌HepG2細(xì)胞DUSP1(2.18倍,RT-PCR及Western blot結(jié)果均已證實(shí))、DUSP5(5.92倍)、DUSP6 (2.89倍)和DUSP13(4.86倍)表達(dá)均明顯升高,而DUSP9(0.44倍)表達(dá)下降,提示溪黃草水提取物可通過升高部分DUSPs活性,抑制MAPK的細(xì)胞增殖作用,從而達(dá)到抗肝癌或其他腫瘤的作用。

      本研究通過芯片和RT-PCR技術(shù)均發(fā)現(xiàn)溪黃草處理后肝癌細(xì)胞ALDH8A1(aldehyde dehydrogenase 8 family,member A1)顯著降低,ALDH8A1主要參與9-順式視黃醛轉(zhuǎn)化為9-順式視黃酸的過程[22],目前關(guān)于其與肝癌的關(guān)系研究較少,溪黃草顯著下降A(chǔ)LDH8A1 mRNA表達(dá)(已通過RT-PCR驗(yàn)證與芯片結(jié)果一致)的作用究竟對(duì)肝癌治療的是利還是弊有待進(jìn)一步研究。法尼酯X受體(farnesoid X receptor,F(xiàn)XR)調(diào)節(jié)膽汁酸代謝、膽固醇代謝、脂代謝,有研究報(bào)道FXR在肝癌組織表達(dá)高于癌旁組織,去除FXR則可自發(fā)生成肝臟腫瘤,激活FXR則可抑制肝癌細(xì)胞增殖[23-25]。本研究顯示,溪黃草水提取物可顯著降低肝癌細(xì)胞FXR的表達(dá),是否會(huì)抑制其抗肝癌作用還有待于進(jìn)一步研究。

      有研究表明溪黃草含有多種活性抗腫瘤成分如二萜類化合物、三萜類化合物、多酚類化合物及活性多糖[26],溪黃草水提取物的抗肝癌作用可能是這多種抗腫瘤活性成分的協(xié)同作用,具體這些活性成分在溪黃草抗抗肝癌中的比重還需進(jìn)一步通過譜-效關(guān)系確定。

      綜上所述,表達(dá)譜芯片表明溪黃草水提取物主要可上調(diào)IGFBPs、DUSPs及CDKNs等抑癌基因的表達(dá),下調(diào)與腫瘤細(xì)胞增殖和DNA復(fù)制相關(guān)的MCMs等基因的表達(dá),進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞增殖和DNA復(fù)制,從而發(fā)揮其抗肝癌作用。但也可能上調(diào)促肝癌發(fā)生、發(fā)展基因(如MMP3、CYP1A1等)的表達(dá),下調(diào)抑制肝癌發(fā)生、發(fā)展基因(如FXR等)的表達(dá),需要辨證或整體看待溪黃草對(duì)肝癌的作用,以及進(jìn)一步研究這些基因整體對(duì)肝癌的調(diào)控作用。

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