呂濤 劉立鵬 李偉杰 欒榮華 趙志敬 胡濤 陶凌 瞿發(fā)林 郭文怡

710032 西安，空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院心血管內(nèi)科(呂濤、劉立鵬、李偉杰、欒榮華、趙志敬、胡濤、陶凌、郭文怡)；848000 和田，93926部隊(duì)醫(yī)院心血管內(nèi)科(瞿發(fā)林)

高膽固醇血癥、高血壓、糖尿病和吸煙等心血管危險(xiǎn)因素可增加血管內(nèi)皮細(xì)胞活性氧(氧化應(yīng)激的主要成份)的產(chǎn)生，從而促進(jìn)脂蛋白氧化修飾、內(nèi)皮細(xì)胞活化等過(guò)程[1]，因此氧化應(yīng)激在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。已有研究表明，雙鏈端粒序列中的長(zhǎng)重復(fù)堿基(包括G堿基三聯(lián)體——主要位于端粒)是氧化應(yīng)激的最好靶目標(biāo)，因此氧化應(yīng)激增加了端?？s短的速率[2]。國(guó)外已有研究探討白細(xì)胞端粒長(zhǎng)度與心血管危險(xiǎn)因素的關(guān)系，但結(jié)論不一致[3-4]，考慮與種族差異有關(guān)[5]。本研究擬在中國(guó)人群中初步探討外周血白細(xì)胞端粒長(zhǎng)度與急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)嚴(yán)重程度和心血管危險(xiǎn)因素的關(guān)系，為進(jìn)一步研究動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象

本研究為單中心開放式橫斷面研究。連續(xù)入選2014年12月至2017年1月在空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院心內(nèi)科住院的患者231例，其中男性170例，年齡31～87歲，平均(58.7±10.4)歲，均接受選擇性冠狀動(dòng)脈造影檢查，并接受外周血白細(xì)胞端粒長(zhǎng)度檢測(cè)。

AMI組患者114例，符合AMI的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；對(duì)照組患者117例，經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影檢查發(fā)現(xiàn)三支血管狹窄程度均<50%。排除標(biāo)準(zhǔn)：惡性腫瘤病史；終末期腎臟疾病或肝功能衰竭；1個(gè)月內(nèi)有輸血史；骨髓移植術(shù)史；感染性疾??；結(jié)締組織?。幻庖呦到y(tǒng)疾??；不接受外周血白細(xì)胞端粒長(zhǎng)度檢測(cè)。本研究經(jīng)空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(NCT02500823)，所有入選患者均簽署知情同意書。

分組方法：(1)根據(jù)Gensini評(píng)分結(jié)果的四分位數(shù)間距將所有入選患者分為4個(gè)亞組：0～5組(61例)、5～27組(56例)、27～71(57例)和71～230(57例)；(2)根據(jù)Framingham危險(xiǎn)因素評(píng)分將患者分為3個(gè)亞組：低危組(<10%)63例、中危組(10%～20%)96例和高危組(>20%)36例。

1.2 臨床基線資料收集

所有入選患者均進(jìn)行完整的病史采集和資料收集，包括吸煙、高血壓、糖尿病和家族史等病史和總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)等生化指標(biāo)。根據(jù)《中國(guó)高血壓防治指南2010》和《中國(guó)糖尿病防治指南》分別定義高血壓和糖尿病。根據(jù)相關(guān)病史(年齡、性別、吸煙和最高血壓)和生化指標(biāo)(HDL-C和TC)計(jì)算患者的Framingham危險(xiǎn)因素評(píng)分。

1.3 冠狀動(dòng)脈狹窄程度評(píng)估

所有入選患者均在空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院心內(nèi)科導(dǎo)管室進(jìn)行選擇性冠狀動(dòng)脈造影。造影結(jié)果由與本課題無(wú)關(guān)的經(jīng)驗(yàn)豐富的兩名專業(yè)醫(yī)師進(jìn)行分析。根據(jù)冠狀動(dòng)脈造影結(jié)果，計(jì)算每位患者的Gensini評(píng)分(狹窄程度×狹窄部位系數(shù))。

1.4 樣本采集和DNA提取

取所有入選患者冠狀動(dòng)脈造影前的外周動(dòng)脈血4 ml裝于5 ml EDTA抗凝管中充分混勻。 采集的血液標(biāo)本置于離心機(jī)中以1 000 r/min離心10 min后去除上清液。將血細(xì)胞成份置于1.5 ml離心管中，并凍存于-80℃冰箱。用E.Z.N.A.血液基因組DNA快速提取試劑盒(Omega Bio-Tek，Norcross，GA)提取樣本的基因組DNA。首先利用紅細(xì)胞裂解液去除不含DNA的紅細(xì)胞；然后通過(guò)裂解液裂解白細(xì)胞，使DNA游離在溶液中，再通過(guò)高鹽沉淀法去除蛋白等雜質(zhì)后獲得用于端粒長(zhǎng)度檢測(cè)的DNA。

1.5 白細(xì)胞端粒長(zhǎng)度檢測(cè)

采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR(quantitative polymerase chain reaction，qPCR)的方法檢測(cè)端粒長(zhǎng)度。端粒長(zhǎng)度=端粒(T)重復(fù)拷貝數(shù)/單拷貝基因(S)，即T/S=[2CT(T)/2CT(S)]-1=2-ΔCT[7]。PCR反應(yīng)液(20 μl)包括10 μl定量PCR預(yù)混合溶液-SybrGreen qPCR Master Mix(2×)(BBI)(Roche)(耐熱DNA聚合酶，SYBR Green Ⅰ染料，dNTP混合物，Mg2+)，7.2 μl重蒸水，0.8 μl引物序列和2 μl DNA模版。T反應(yīng)引物：正向引物：5′-ACACTAAGGTTTGGGTT TGGGTTTGGGTTTGGGTTAGTGT-3′，反向引物：5′-TGTTAGGTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTATCC CTAACA-3′；S反應(yīng)引物：正向引物：5′-GTGCACC TGACTCCTGAGGAGA-3′，反向引物：5′-CCTTGATAC CAACCTGCCCAG-3′。PCR的熱循環(huán)條件為3 min 95℃(7 s 95℃變性、10 s 57℃復(fù)性、15 s 72℃延長(zhǎng))共45個(gè)周期。在完成上述步驟后，把加好樣品的96/384孔板放在LightCycler480 Software Setup(Roche羅氏)中進(jìn)行反應(yīng)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 臨床基線資料比較

兩組患者臨床基線資料比較，性別、吸煙、糖尿病、HDL-C水平、血鉀和心肌損傷標(biāo)志物的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，見表1。

表1 AMI組與對(duì)照組患者臨床基線資料比較

2.2 白細(xì)胞端粒長(zhǎng)度比較

AMI患者與對(duì)照組患者外周血白細(xì)胞端粒長(zhǎng)度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(非參數(shù)檢驗(yàn)Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，組間P<0.05)，見圖1。亞組分析顯示，AMI與對(duì)照組患者白細(xì)胞端粒長(zhǎng)度在高齡(>59歲)、男性、非高血壓、收縮壓≤150 mmHg、LDL-C≤2.1 mmol/L以及Framingham危險(xiǎn)因素評(píng)分中危組中存在差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，見表2。

2.3 白細(xì)胞端粒長(zhǎng)度與Gensini評(píng)分的關(guān)系

根據(jù)Gensini評(píng)分的四分位數(shù)間距將研究對(duì)象分為4組，見表3。采用非參數(shù)Kruskal-Wallis檢驗(yàn)分析顯示，4組間外周血白細(xì)胞端粒長(zhǎng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.93，P<0.05)，見圖2。采用Spearman相關(guān)分析外周血白細(xì)胞端粒長(zhǎng)度與Gensini評(píng)分的關(guān)系，顯示二者呈負(fù)相關(guān)(r=-0.175，P<0.01)，見圖3。

2.4 白細(xì)胞端粒長(zhǎng)度與心血管危險(xiǎn)因素的關(guān)系

表2 AMI組和對(duì)照組白細(xì)胞端粒長(zhǎng)度差異

表3 Gensini評(píng)分不同組間白細(xì)胞端粒長(zhǎng)度比較[M(Q25，Q75)]

圖1 AMI組與對(duì)照組患者白細(xì)胞端粒長(zhǎng)度比較

圖2 Gensini評(píng)分組間白細(xì)胞端粒長(zhǎng)度比較

圖3 白細(xì)胞端粒長(zhǎng)度與Gensini評(píng)分的關(guān)系

在AMI患者或?qū)φ战M患者中，未來(lái)10年發(fā)生心臟病風(fēng)險(xiǎn)不同組間的白細(xì)胞端粒長(zhǎng)度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)，見表2。采用Spearman相關(guān)分析外周血白細(xì)胞端粒長(zhǎng)度與心血管危險(xiǎn)因素的關(guān)系，結(jié)果顯示白細(xì)胞端粒長(zhǎng)度與收縮壓(r=0.14，P=0.04)和HDL-C(r=0.16，P=0.03)相關(guān)，與其他心血管危險(xiǎn)因素均無(wú)相關(guān)性(均為P>0.05)，見表4。

3 討論

表4 白細(xì)胞端粒長(zhǎng)度與心血管危險(xiǎn)因素的關(guān)系

端粒的作用是維持染色體的穩(wěn)定性和DNA復(fù)制的完整性。DNA分子每分裂復(fù)制一次，端粒就縮短一點(diǎn)(約50 kb)，一旦端粒消耗殆盡，細(xì)胞將會(huì)立即激活凋亡機(jī)制，即細(xì)胞走向凋亡。所以端粒長(zhǎng)度可以作為心血管衰老過(guò)程中的重要標(biāo)志物[8]。大量基礎(chǔ)和臨床研究已經(jīng)證明，氧化應(yīng)激可以縮短端粒[9]。正常情況下，端粒以一定的速率縮短，當(dāng)體內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平增加，超過(guò)了端粒的保護(hù)因素(shelterin蛋白復(fù)合體[10]等)，將增加端?？s短的速率。

動(dòng)脈粥樣硬化的病理生理機(jī)制至今尚未明確，氧化應(yīng)激損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生和演變的重要環(huán)節(jié)。在血管壁，ROS——氧化應(yīng)激的主要成分由幾種酶系產(chǎn)生，包括NADPH氧化酶、黃嘌呤氧化酶、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)和線粒體電子傳遞鏈；另一方面，體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)(超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和對(duì)氧磷酶)被激活清除ROS。然而，當(dāng)過(guò)量的ROS產(chǎn)生超過(guò)了抗氧化酶系統(tǒng)的清除能力時(shí)，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，而氧化應(yīng)激可以促進(jìn)脂蛋白氧化修飾、內(nèi)皮細(xì)胞活化和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)激活等動(dòng)脈粥樣硬化形成過(guò)程，這就是氧化應(yīng)激導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的主要機(jī)制[1]。ROS損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，增加血管內(nèi)皮細(xì)胞中的端?？s短速率。

Nzietchueng等[11]采用橫斷面研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)動(dòng)脈粥樣硬化的動(dòng)脈比動(dòng)脈粥樣硬化相應(yīng)動(dòng)脈端粒更長(zhǎng)(P<0.05)。以往研究顯示，外周血白細(xì)胞端粒長(zhǎng)度與血管壁組織中的端粒長(zhǎng)度顯著相關(guān)(r=0.62，P<0.001)[12]，所以本研究選擇外周血白細(xì)胞端粒長(zhǎng)度替代血管壁組織中的端粒長(zhǎng)度探討端粒長(zhǎng)度與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系。而測(cè)量外周血白細(xì)胞端粒長(zhǎng)度更容易應(yīng)用于臨床檢測(cè)，且創(chuàng)傷小。

以往關(guān)于端粒長(zhǎng)度與心血管疾病的研究大多集中于端粒長(zhǎng)度與冠心病的關(guān)系，因AMI的高致死率特征，本研究探討端粒長(zhǎng)度與AMI的關(guān)系。盡管已有國(guó)外研究探討了端粒長(zhǎng)度與AMI的關(guān)系[13]，但其并未闡明端粒長(zhǎng)度與AMI嚴(yán)重程度的關(guān)系，況且端粒長(zhǎng)度本身存在種族差異[5]，所以本研究主要探討在中國(guó)漢族人群中端粒長(zhǎng)度與AMI嚴(yán)重程度的關(guān)系。

所有的心血管危險(xiǎn)因素都能增強(qiáng)氧化應(yīng)激并誘導(dǎo)eNOS在血管壁中的解耦聯(lián)。eNOS的解耦聯(lián)不僅導(dǎo)致內(nèi)皮NO產(chǎn)生減少，而且還可以進(jìn)一步促進(jìn)血管壁中的氧化應(yīng)激，從而增加端?？s短的速度[14]。國(guó)外已有臨床試驗(yàn)探討了端粒長(zhǎng)度與心血管危險(xiǎn)因素的關(guān)系，但結(jié)論不一致。Valdes等[3]在白人女性人群中發(fā)現(xiàn)端粒長(zhǎng)度與年齡、肥胖、吸煙均有關(guān)系，而Neuner等[4]在德國(guó)獻(xiàn)血人群中并未發(fā)現(xiàn)與心血管危險(xiǎn)因素的關(guān)系。本研究采用Framingham評(píng)分綜合評(píng)估心血管危險(xiǎn)因素，并通過(guò)相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)在中國(guó)漢族人群中端粒長(zhǎng)度與心血管危險(xiǎn)因素?zé)o顯著相關(guān)性。

外周血白細(xì)胞端粒長(zhǎng)度或可作為一種有力的預(yù)測(cè)因子來(lái)評(píng)估AMI的嚴(yán)重程度，為進(jìn)一步研究動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制提供參考依據(jù)。由于本研究樣本量較少，且為單中心研究，入選研究對(duì)象過(guò)程中可能存在因疾病嚴(yán)重程度而造成的選擇偏倚，后續(xù)研究將擴(kuò)大樣本量、增加研究中心數(shù)量和對(duì)入選患者進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪以減少偏倚。

利益沖突：無(wú)

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