包久兵，史良會(huì)

（1.皖南醫(yī)學(xué)院研究生院，安徽 蕪湖 241001；2.皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院胃腸外科）

結(jié)直腸癌（CRC）是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在腫瘤導(dǎo)致的死亡中居第5位［1］，預(yù)計(jì)到2030年，全球CRC的發(fā)病率將增加60%［2］。對(duì)CRC侵襲及轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制及腫瘤細(xì)胞與外界信息交流的機(jī)制的了解，將有助于進(jìn)一步預(yù)防和治療CRC，其中外泌體介導(dǎo)的運(yùn)輸形式發(fā)揮著重要作用。癌細(xì)胞能釋放多種囊泡，這些囊泡可以通過(guò)體液，如外周血、唾液、尿液和腹水等進(jìn)行轉(zhuǎn)移［3］，某些特殊的細(xì)胞囊泡稱為“外泌體（exosomes）”，其與癌癥的進(jìn)展相關(guān)［4］。

1 外泌體

1.1 外泌體的產(chǎn)生 外泌體是在內(nèi)化過(guò)程中由質(zhì)膜產(chǎn)生的。首先，細(xì)胞通過(guò)內(nèi)吞作用形成早期內(nèi)涵體（early endosomes，EE），其逐漸變?yōu)橥砥趦?nèi)涵體或多泡體（MVBs），MVBs膜內(nèi)陷形成腔內(nèi)囊泡（ILVs），MVBs與溶酶體膜融合可降解蛋白質(zhì)，并且釋放ILVs進(jìn)入溶酶體，或者M(jìn)VBs與質(zhì)膜融合，ILVs被釋放到細(xì)胞外環(huán)境中，稱為外泌體［5］。外泌體融合了mRNA、miRNA、蛋白質(zhì)和部分特定區(qū)域的DNA等。外泌體的大小在30～100 nm［6］，40～100 nm［7］，50～150 nm［8］不等。然而，外泌體的生物起源機(jī)制尚不十分清楚，還需要進(jìn)行更深入的研究。

1.2 外泌體的分離方法 根據(jù)其大小、密度、含量、標(biāo)記物或電位等一些自身特點(diǎn)，從血漿、血清、培養(yǎng)基中分離外泌體的方法有多種。第一種分離方法是超速離心法，因其性能高、操作簡(jiǎn)單和易獲得性而被廣泛應(yīng)用［9］。為了從細(xì)胞培養(yǎng)物中分離外泌體，必須使用無(wú)血清培養(yǎng)基或補(bǔ)充除外泌體的血清培養(yǎng)基來(lái)避免可能對(duì)結(jié)果造成干擾。超速離心法實(shí)施方案：先將上清液以480×g離心5 min，然后再用2 000×g離心10 min，移除細(xì)胞和細(xì)胞碎片［8，10］；取離心后的上清液，用0.2 μm孔過(guò)濾除去大的囊泡，在4℃以100 000×g離心60 min；將沉淀重懸于PBS中，通過(guò)蔗糖梯度離心法，在4℃以100 000×g離心60 min進(jìn)行純化，所得含有外泌體的物質(zhì)必須用PBS洗滌并儲(chǔ)存在-80 ℃環(huán)境中［11］。

近年來(lái)，超速離心的替代方法（包括超濾［12］）與日俱增。BiooScientific研發(fā)了“ExoMir Kit”試劑盒，通過(guò)第一個(gè)微濾器（0.22 μm）移除細(xì)胞和細(xì)胞碎片等，通過(guò)第二個(gè)微濾器（0.02 μm），使用正壓驅(qū)動(dòng)流動(dòng)并最終獲取外泌體［13］。另外一種方法是：通過(guò)使用針對(duì)膜蛋白如CD9、CD63、CD81、CD82、Alix、膜聯(lián)蛋白、EpCAM和Rab5的抗體來(lái)特異性分離外泌體，這些抗體被固定在層析基質(zhì)或平板上［14］。值得強(qiáng)調(diào)的是，對(duì)于外體的分離、純化、量化或儲(chǔ)存，并沒(méi)有一種普遍的方法。我們期待在不久的將來(lái)研究出一種普遍適用的方法，這將促進(jìn)腫瘤的進(jìn)一步研究。外泌體分離出來(lái)后，可以通過(guò)不同的技術(shù)如ELISA、Western blot、流式細(xì)胞術(shù)，qPCR、蛋白質(zhì)組學(xué)或NanoSight等，分析其組成或定量。

2 CRC來(lái)源外泌體

外泌體可以攜帶致癌蛋白、腫瘤抑制因子、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、剪接因子等多種蛋白質(zhì)和RNA（mRNA、miRNA和其他非編碼RNA）［8］。外泌體內(nèi)還包含某些DNA片段，這可能提供有關(guān)癌細(xì)胞起源的相關(guān)信息［15-16］。此外，外泌體還可以運(yùn)輸和遞送大量的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸，并且可以修飾細(xì)胞和器官功能［4］。

目前常用下列細(xì)胞系來(lái)研究CRC，如LIM1215、LIM1863、HCT-15、SW480、SW620、DiFi和WiDr等。這些細(xì)胞系的囊泡含有高濃度的細(xì)胞黏附蛋白以及參與分子運(yùn)輸?shù)牡鞍缀桶饣|(zhì)蛋白。Ji等［8］通過(guò)免疫親和力的方法，在LIM1863細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)了2種外泌體（E-A33和E-EpCAM），其miRNA種類具有顯著差異，E-A33特異性富集了33種miRNAs，其中14種miRNAs在CRC組織分析中未曾報(bào)道過(guò)，其可能作為診斷CRC的潛在生物標(biāo)記物。Mitsuru等［7］檢測(cè)了CRC細(xì)胞系HCT-15、SW480和WiDr分泌的外泌體內(nèi)的RNA種類，發(fā)現(xiàn)了管家基因ACTB mRNA和GAPDH mRNA，miR-21、miR-192、miR-221，以及LRRC24、MDM2和CDKN1A基因的天然反義RNA，這也是首次發(fā)現(xiàn)在外泌體內(nèi)存在天然反義RNA；此外，還發(fā)現(xiàn)來(lái)源于CRC細(xì)胞系的PKH67標(biāo)記的外來(lái)體被攝取到HepG2和A549細(xì)胞中；這些發(fā)現(xiàn)表明，細(xì)胞內(nèi)RNA通過(guò)外泌體分泌到細(xì)胞外，并且源自CRC細(xì)胞系的外泌體能夠轉(zhuǎn)移至HepG2和A549細(xì)胞中，外泌體中的RNA在細(xì)胞間穿梭，可能參與調(diào)節(jié)受體細(xì)胞中的基因表達(dá)。

Ji等［10］分析比較了來(lái)自 SW480細(xì)胞系（ESW480）和其轉(zhuǎn)移性SW620細(xì)胞系（E-SW620）的“外泌體”中的蛋白表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)兩者均含有典型的外泌體標(biāo)記物TSG101、Alix、CD63；而轉(zhuǎn)移因子（MET、S100A8、S100A9、TNC）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子（EFNB2、JAG1、SRC、TNIK）和脂質(zhì)筏及其相關(guān)成分（CAV1、FLOT1、FLOT2、PROM1）選擇性富集于E-SW620中；此外，在E-SW620中也發(fā)現(xiàn)了高水平的Src家族激酶，其與E-SW620中脂筏及其相關(guān)分子CAV1、FLOT1和FLOT2相互作用，參與了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、內(nèi)吞和細(xì)胞骨架重塑，提示它們?cè)谛盘?hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用，可促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤進(jìn)展。據(jù)報(bào)道，包裹在E-SW620中的七次跨膜磷酸化酪氨酸激酶可能參與調(diào)節(jié)外泌體的生命周期［17］。

KRAS基因在30%～40%的CRC腫瘤中出現(xiàn)了突變，Demory Beckler等［6］研究發(fā)現(xiàn)，與表達(dá)野生型KRAS的CRC細(xì)胞分泌的外泌體相比，表達(dá)突變型KRAS的細(xì)胞分泌的外泌體可增強(qiáng)受體細(xì)胞的侵襲性，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，KRAS突變可顯著影響外泌體的蛋白質(zhì)組成，突變型KRAS的細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體含有多種促腫瘤蛋白，包括Src家族激酶、EGFR、整合蛋白和突變KRAS蛋白；含突變型KRAS的外泌體可被內(nèi)化并將突變型KRAS轉(zhuǎn)移至含野生型KRAS蛋白的DKs-8細(xì)胞中，從而促進(jìn)DKs-8細(xì)胞的黏附和增殖。此外，有研究發(fā)現(xiàn)miR-100在含突變型KRAS蛋白的外泌體中顯著增加［18］。

Lydic等［19］比較分析了CRC細(xì)胞系LIM1215和其分泌的外泌體的脂質(zhì)譜，結(jié)果顯示在外泌體中存在某些脂質(zhì)的富集，包括鞘脂、固醇脂質(zhì)、甘油脂、甘油磷脂、縮醛磷脂等。

3 外泌體在CRC細(xì)胞中的作用

3.1 參與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和增殖 腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制是上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）。EMT機(jī)制與癌癥的發(fā)生、癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移以及復(fù)發(fā)的早期階段有關(guān)［20］。研究表明，腫瘤來(lái)源的外泌體可以促進(jìn)受體細(xì)胞的EMT過(guò)程［21］。Bigagli等［22］研究發(fā)現(xiàn)，CRC細(xì)胞系HCT-8在培養(yǎng)7 d后，一些細(xì)胞開(kāi)始在懸浮液中生長(zhǎng)，細(xì)胞呈E-鈣黏蛋白陰性和波形蛋白陽(yáng)性，表明細(xì)胞具有失巢凋亡抵抗和轉(zhuǎn)移潛能；通過(guò)電子顯微鏡分析發(fā)現(xiàn)，由貼壁細(xì)胞分泌的外泌體可被轉(zhuǎn)移性細(xì)胞吸收，并且貼壁細(xì)胞分泌的外泌體中的miR-210水平顯著高于細(xì)胞內(nèi)水平，因此miR-210可能是EMT的觸發(fā)信號(hào)，促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

除了影響EMT過(guò)程外，從SW620和SW480細(xì)胞系中提取的外泌體能夠顯著增加2F2B小鼠內(nèi)皮細(xì)胞的體外增殖，從而促進(jìn)腫瘤血管的生長(zhǎng)［10］。這種對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的影響可能與外泌體中富集細(xì)胞周期相關(guān)基因mRNA有關(guān)，這些富集的mRNA主要與細(xì)胞周期M期活性相關(guān)，在腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用［23］。CRC來(lái)源外泌體能夠誘導(dǎo)結(jié)腸間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）的形態(tài)和功能改變，誘導(dǎo)后的MSCs具有非典型的形態(tài)并且具有更高的增殖率、遷移率和侵襲性［24］。Mulvey等［25］研究發(fā)現(xiàn)，用來(lái)自CRC細(xì)胞系HCT116和惡性CRC患者組織的外泌體誘導(dǎo)正常結(jié)腸成纖維細(xì)胞時(shí)，可誘導(dǎo)其產(chǎn)生惡性表型，同樣地，用來(lái)自正常結(jié)腸成纖維細(xì)胞和正?；颊呓M織的外泌體誘導(dǎo)，逆轉(zhuǎn)了HCT116細(xì)胞的惡性表型。還有研究發(fā)現(xiàn)，來(lái)自小鼠CRC細(xì)胞系CT26的外泌體顯著促進(jìn)了腫瘤的生長(zhǎng)，并降低了動(dòng)物的存活率；此外，發(fā)現(xiàn)外泌體能夠?qū)⒕奘杉?xì)胞的M1表型轉(zhuǎn)變?yōu)镸2表型，并與腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞因子和趨化因子相互作用，從而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)［26］。

3.2 參與腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移 Wang等［27］研究發(fā)現(xiàn)，源自高度肝轉(zhuǎn)移性CRC細(xì)胞系HT-29的外泌體可通過(guò)招募表達(dá)趨化因子受體4（CXCR4）的基質(zhì)細(xì)胞來(lái)促成轉(zhuǎn)移性微環(huán)境，進(jìn)而促進(jìn)CRC的肝轉(zhuǎn)移。Senfter等［28］研究發(fā)現(xiàn)，CRC細(xì)胞系CCL227分泌的外泌體含有miR-200家族成員，可轉(zhuǎn)移至鄰近的淋巴內(nèi)皮細(xì)胞中，抑制調(diào)控EMT的轉(zhuǎn)錄因子ZEB1和SLUG的表達(dá)，外泌體中miR-200c的缺失可能導(dǎo)致鄰近內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生侵襲、遷移能力。此外，缺氧狀態(tài)下的CRC細(xì)胞釋放的外泌體能夠通過(guò)富集Wnt4來(lái)增加內(nèi)皮細(xì)胞中的β-連環(huán)蛋白核轉(zhuǎn)運(yùn)來(lái)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，在動(dòng)物體內(nèi)研究也證實(shí)CRC細(xì)胞分泌的外泌體能促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)以及加快血管生成［29］。由CRC細(xì)胞Caco-2分泌的外泌體含有Wnt5b蛋白，能夠刺激A549細(xì)胞中的Wnt5b信號(hào)傳導(dǎo)，促進(jìn)A549細(xì)胞的遷移和增殖［30］。在CRC患者中，APC（腺瘤性結(jié)腸息肉?。┠[瘤抑制基因的突變很常見(jiàn)，并且與Wnt信號(hào)傳導(dǎo)失調(diào)有關(guān)，當(dāng)SW480中穩(wěn)定表達(dá)野生型APC時(shí)，細(xì)胞表現(xiàn)出減弱的Wnt信號(hào)傳導(dǎo)，并降低致瘤性；蛋白質(zhì)組分析表明SW480 APC細(xì)胞分泌的外泌體特異性表達(dá)Wnt拮抗劑DKK4，這可能是調(diào)控Wnt信號(hào)通路在CRC發(fā)展過(guò)程中丟失的機(jī)制［31］。

值得注意的是，不管是在體外或體內(nèi)的研究已經(jīng)表明，CRC細(xì)胞的外泌體能通過(guò)腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）和Fas配體（FasL）誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡，這有助于腫瘤細(xì)胞逃避免疫系統(tǒng)的“監(jiān)視”［32］。

4 小結(jié)與展望

癌細(xì)胞分泌的外泌體可被靶細(xì)胞攝取，在細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，促進(jìn)腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等。作為細(xì)胞間通訊載體的外泌體可作為CRC診斷和預(yù)后的有效生物標(biāo)志物。從非侵入性液體活組織中分離的CRC外泌體的核酸和其他成分可以作為CRC早期診斷和預(yù)后監(jiān)測(cè)的有效指標(biāo)。CRC來(lái)源外泌體也具有潛在的臨床實(shí)用性，其可作為攜帶RNA、蛋白質(zhì)和藥物并作用于靶細(xì)胞的載體。外泌體分泌后可以將其攜帶的內(nèi)容物傳遞至相鄰或遠(yuǎn)處的細(xì)胞，并且可以調(diào)節(jié)受體細(xì)胞中的基因表達(dá)、信號(hào)傳導(dǎo)或整體功能。抑制腫瘤外泌體的的釋放，可作為干擾腫瘤的生物學(xué)進(jìn)展以及減少耐藥性產(chǎn)生的一種治療癌癥方法。在大多數(shù)的研究中，外泌體是從體外培養(yǎng)物中提取的，并且使用的濃度與生理?xiàng)l件有所差別。體外模型提供了有效的工具來(lái)實(shí)現(xiàn)快速和有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。然而，為了加深對(duì)CRC來(lái)源外泌體的認(rèn)識(shí)及其臨床意義，需要更多的體內(nèi)研究來(lái)評(píng)估CRC來(lái)源外泌體在腫瘤增殖、宿主免疫調(diào)控、血管生成和對(duì)治療的反應(yīng)以及其他方面的作用。