支氣管肺泡灌洗在自身免疫特征的間質(zhì)性肺炎與結(jié)締組織病相關(guān)間質(zhì)性肺疾病中的應(yīng)用*

杜毅鵬 葛欣宜 周 晨 張雪陽 沈 寧 賀 蓓

(北京大學(xué)第三醫(yī)院呼吸科，北京 100191)

間質(zhì)性肺疾病(interstitial lung disease，ILD)包括200余種不同的疾患，其中結(jié)締組織病(connective tissue disease，CTD)是常見的原因之一。多種結(jié)締組織疾病都可以出現(xiàn)ILD，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatic arthritis，RA)、系統(tǒng)性硬化(systemic sclerosis，SSc)、多發(fā)性肌炎和皮肌炎(polymyositis/dermatomyositis，PM/DM)、干燥綜合征(Sj?gren’s syndrome，SS)等，并且ILD可能是CTD首發(fā)且唯一的臨床表現(xiàn)[1,2]。近年臨床上發(fā)現(xiàn)部分ILD雖然臨床癥狀、自身血清學(xué)抗體及高分辨率CT(high resolution CT，HRCT)等影像學(xué)特征均提示可能有潛在的自身免疫紊亂，但卻不滿足CTD-ILD的診斷要求，歐洲呼吸學(xué)會/美國胸科學(xué)會(European Respiratory Society/American Thoracic Society，ERS/ATS)于2015年提出了“自身免疫特征的間質(zhì)性肺炎”(interstitial pneumonia with autoimmune features，IPAF)的定義[3]，同時制定IPAF診斷標(biāo)準(zhǔn)，為進(jìn)一步深入研究這類疾病提供了可能。但目前對于IPAF的臨床特征的認(rèn)識尚不充分，與CTD-ILD的異同也不明確。支氣管肺泡灌洗(bronchoalverolar lavage,BAL)是經(jīng)支氣管鏡獲取下呼吸道肺泡來源的細(xì)胞與生化成分，探討肺臟局部免疫病理過程的一種較為安全的臨床檢查手段，又被稱為“液性肺活檢”，在多種肺部疾病的診斷和治療中發(fā)揮重要作用[4]。特別在ILD的診斷中，BAL結(jié)合臨床、影像學(xué)表現(xiàn)可以支持某種ILD診斷或縮小鑒別診斷的范圍[5]。與HRCT和肺功能檢查相比較，BAL檢查敏感性更高，可以更早地發(fā)現(xiàn)ILD導(dǎo)致的肺泡炎改變；而與外科肺活檢相比較，BAL檢查創(chuàng)傷小，安全性更好，病人更容易接受，臨床可操作性更佳。本研究對2014年1月～2017年12月符合診斷標(biāo)準(zhǔn)的IPAF和CTD-ILD進(jìn)行回顧性分析，比較兩者在基本資料、臨床表現(xiàn)、支氣管肺泡灌洗液(bronchoalverolar lavage fluid，BALF)細(xì)胞分類計(jì)數(shù)、肺功能及影像學(xué)上的異同，為進(jìn)一步早期識別IPAF和CTD-ILD提供基礎(chǔ)。

1 臨床資料與方法

1.1 一般資料

CTD-ILD組28例，男6例，女22例。年齡30～77歲，(56±13)歲。呼吸系統(tǒng)表現(xiàn)咳嗽、咳痰22例，呼吸困難19例；肺外多系統(tǒng)表現(xiàn)為皮膚表現(xiàn)13例(包括Gottron征或技工手9例，眼瞼紫紅色皮疹2例，手指浮腫1例，遠(yuǎn)端指尖皮膚潰瘍1例)，關(guān)節(jié)癥狀13例(包括關(guān)節(jié)畸形4例，關(guān)節(jié)炎或多關(guān)節(jié)晨僵8例，雷諾現(xiàn)象1例)，肌痛、肌力下降5例，干燥癥狀5例。肺功能檢查提示通氣功能正常6例，限制性通氣功能障礙21例，混合性通氣功能障礙1例；彌散功能降低20例，正常2例(6例未作彌散功能檢查)。BALF中性粒細(xì)胞升高(>3%)21例(3.5%～80%)，淋巴細(xì)胞升高(>15%)16例(16%～66%)，嗜酸性粒細(xì)胞升高(>1%)12例(1.5%～49%)，正常1例。肺HRCT表現(xiàn)為網(wǎng)格狀影16例，斑片狀影16例，磨玻璃影15例，胸膜增厚7例，支氣管牽拉征象6例。血清學(xué)抗核抗體≥1∶320 9例，抗SS-A抗體(+)10例，抗SS-B抗體(+)4例，RF(+)9例，抗CCP抗體(+)4例，抗RNP抗體(+)4例，抗Jo-1抗體(+)2例，抗Ro-52抗體(+)2例。其中診斷干燥綜合征12例，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎4例，肌炎/皮肌炎11例，系統(tǒng)性硬化1例。

IPAF組19例，男7例，女12例。年齡45～78歲，(65±10)歲。呼吸系統(tǒng)表現(xiàn)為咳嗽、咳痰16例，呼吸困難14例；肺外多系統(tǒng)表現(xiàn)為皮膚表現(xiàn)2例(包括手指浮腫1例，遠(yuǎn)端指尖皮膚潰瘍1例)，關(guān)節(jié)癥狀8例(包括關(guān)節(jié)炎或多關(guān)節(jié)晨僵7例，雷諾現(xiàn)象1例)，肌痛、肌力下降3例，干燥癥狀10例。肺功能檢查提示通氣功能正常9例，限制性通氣功能障礙10例；彌散功能降低15例，正常2例(2例未作彌散功能檢查)。BALF中性粒細(xì)胞升高11例(4%～61%)，淋巴細(xì)胞升高13例(16%～88%)，嗜酸性粒細(xì)胞升高12例(2%～47%)，正常1例。肺HRCT表現(xiàn)為網(wǎng)格狀影14例，斑片狀影13例，磨玻璃影11例，胸膜增厚7例，支氣管牽拉征象7例。血清學(xué)抗核抗體≥1∶320 4例，抗SS-A抗體(+)4例，抗SS-B抗體(+)2例，RF(+) 7例，抗CCP抗體(+)2例，抗RNP抗體(+)1例，抗Jo-1抗體(+)2例，抗Ro-52抗體(+)2例。

1.2 方法

1.2.1 診斷流程和標(biāo)準(zhǔn) 患者均就診于呼吸科或風(fēng)濕免疫科，肺HRCT檢查證實(shí)存在ILD，然后進(jìn)行BAL、肺功能及自身抗體檢查，進(jìn)一步根據(jù)臨床表現(xiàn)完善淚腺分泌試驗(yàn)或唇腺活檢、肌電圖或肌活檢、關(guān)節(jié)X線片等檢查以明確CTD的診斷。行BAL前發(fā)熱、血白細(xì)胞升高或痰培養(yǎng)陽性者考慮存在肺部感染，予以排除。

CTD-ILD診斷標(biāo)準(zhǔn)：同時符合HRCT提示ILD且排除其他可能引起ILD的疾病，并患有以下一種疾?。孩俑稍锞C合征：符合2012年美國風(fēng)濕病協(xié)會(American College of Rheumatology，ACR)干燥綜合征分類標(biāo)準(zhǔn)[6]；②類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎：符合2010年ACR類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎分類標(biāo)準(zhǔn)[7]；③肌炎/皮肌炎：符合1975年Bohan等[8]提出的診斷標(biāo)準(zhǔn)；④系統(tǒng)性硬化癥：符合ACR于2013年提出的診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]。

IPAF診斷標(biāo)準(zhǔn)：符合2015年ERS/ATS提出的IPAF共識的標(biāo)準(zhǔn)[3]。首先符合3個必要的前提條件：①HRCT或外科肺活檢證實(shí)存在ILD；②除外其他已知原因所致ILD；③不符合任何一種既定結(jié)締組織疾病的診斷標(biāo)準(zhǔn)。在臨床表現(xiàn)、血清學(xué)特點(diǎn)、影像學(xué)或病理學(xué)3個領(lǐng)域中至少2個領(lǐng)域有1個以上特性存在，方可診斷為IPAF。

1.2.2 BAL方法 對彌漫性間質(zhì)性肺疾病選擇右肺中葉或左肺上葉舌段，局限性病變?yōu)橄鄳?yīng)支氣管肺段進(jìn)行BAL。灌洗液體使用常溫生理鹽水，每次50 ml，總量100～150 ml，一般不超過300 ml。立即用負(fù)壓吸引以50～100 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)負(fù)壓回收灌洗液，通?；厥章蕿?0%～60%。將回收液體立即送實(shí)驗(yàn)室檢查，在2小時內(nèi)處理。

BALF細(xì)胞總數(shù)和分類計(jì)數(shù)檢測：把回收的BALF經(jīng)雙層無菌紗布過濾后以1500 r/min離心10 min，沉淀的細(xì)胞成分用生理鹽水沖洗后，加Shandon細(xì)胞收集液制成細(xì)胞懸液并固定細(xì)胞。取原液l μl在細(xì)胞計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)，結(jié)合BALF回收總量計(jì)算BALF細(xì)胞總數(shù)。將細(xì)胞沉淀重懸后調(diào)整細(xì)胞濃度，涂片，做瑞士-吉姆薩染色，在高倍鏡下按一定方向數(shù)400個非上皮的有核細(xì)胞，分別計(jì)數(shù)出中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞所占細(xì)胞總數(shù)的百分比。根據(jù)ATS 2012年相關(guān)臨床指南對BALF的操作、處理及結(jié)果的解讀[10]，按BALF細(xì)胞學(xué)分析結(jié)果分類，分為淋巴細(xì)胞為主型(淋巴細(xì)胞>15%)，中性粒細(xì)胞為主型(中性粒細(xì)胞>3%)，嗜酸性粒細(xì)胞為主型(嗜酸性粒細(xì)胞>1%)。

BALF中T淋巴細(xì)胞亞群檢測：采用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)法，將回收的BALF過濾，用磷酸鹽緩沖液制成細(xì)胞懸液，經(jīng)貼壁處理去除肺泡巨噬細(xì)胞。通過單克隆抗體CD3、CD4和CD8作用2分鐘后，通過流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 2組BALF細(xì)胞總數(shù)及分類計(jì)數(shù)的比較

CTD-ILD組BALF表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞+中性粒細(xì)胞+嗜酸性粒細(xì)胞混合升高4例，中性粒細(xì)胞+淋巴細(xì)胞混合升高6例，中性粒細(xì)胞+嗜酸性粒細(xì)胞混合升高7例，淋巴細(xì)胞+嗜酸性粒細(xì)胞混合升高1例，中性粒細(xì)胞單獨(dú)升高4例，淋巴細(xì)胞單獨(dú)升高5例，正常1例；IPAF組BALF表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞+中性粒細(xì)胞+嗜酸性粒細(xì)胞混合升高4例，中性粒細(xì)胞+淋巴細(xì)胞混合升高2例，中性粒細(xì)胞+嗜酸性粒細(xì)胞混合升高4例，淋巴細(xì)胞+嗜酸性粒細(xì)胞混合升高4例，中性粒細(xì)胞單獨(dú)升高1例，淋巴細(xì)胞單獨(dú)升高3例，正常1例。

2組BALF細(xì)胞總數(shù)及分類計(jì)數(shù)的比較見表1，CTD-ILD組BALF中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)較IPAF組顯著增高(P=0.009)。對T淋巴細(xì)胞進(jìn)行亞群分析，2組CD4+淋巴細(xì)胞百分比及CD8+淋巴細(xì)胞百分比組間比較均無顯著性差異(P>0.05)。

表1 2組BALF細(xì)胞總數(shù)及分類計(jì)數(shù)的比較

CTD-ILD：結(jié)締組織病相關(guān)間質(zhì)性肺疾??；IPAF：自身免疫特征的間質(zhì)性肺炎;BALF:支氣管肺泡灌洗液

2.2 2組臨床資料及肺功能比較

見表2，CTD-ILD組比IPAF組更年輕，皮膚表現(xiàn)多，干燥癥狀少，差異有顯著性(P<0.05)，2組性別構(gòu)成、其他癥狀、肺功能無顯著性差異(P>0.05)。

2.3 2組血清學(xué)自身抗體及影像學(xué)表現(xiàn)的比較

見表3，2組血清學(xué)自身抗體及影像學(xué)表現(xiàn)(肺HRCT)均無顯著性差異(P>0.05)。

表2 2組臨床資料及肺功能的比較

CTD-ILD：結(jié)締組織病相關(guān)間質(zhì)性肺疾??；IPAF：自身免疫特征的間質(zhì)性肺炎；FEV1%：第1秒用力肺活量占預(yù)計(jì)值百分比；FVC%：用力肺活量占預(yù)計(jì)值百分比；TLC%：肺總量占預(yù)計(jì)值百分比；DLCO%：一氧化碳彌散率占預(yù)計(jì)值百分比

表3 2組血清學(xué)自身抗體及影像學(xué)表現(xiàn)的比較

CTD-ILD：結(jié)締組織病相關(guān)間質(zhì)性肺疾?。籌PAF：自身免疫特征的間質(zhì)性肺炎

3 討論

ILD亦稱彌漫性實(shí)質(zhì)性肺疾病(diffuse parenchymal lung disease，DPLD)，病因包括已知與未知兩大類，已知病因中以CTD最常見。目前CTD-ILD的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，可能與免疫、感染、藥物、化學(xué)、射線以及遺傳等有關(guān)[11]。其中與細(xì)胞因子及細(xì)胞亞群變化的關(guān)系最為密切，TNF-α、TNF-β及炎癥介質(zhì)，還有CD4+淋巴細(xì)胞及B淋巴細(xì)胞協(xié)同產(chǎn)生的大量抗體，均在CTD-ILD的發(fā)生發(fā)展中起至關(guān)重要的作用。它們共同作用于成纖維細(xì)胞，使成纖維細(xì)胞激活增生。成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞，產(chǎn)生大量膠原蛋白，最終導(dǎo)致肺纖維化的形成，大量肺泡結(jié)構(gòu)破壞[12,13]。IPAF在臨床上介于特發(fā)性間質(zhì)性肺炎(idiopathic interstitial pneumonia，IIP)與CTD-ILD的交叉領(lǐng)域，患者以ILD為主要或唯一表現(xiàn)，同時存在部分血清學(xué)自身抗體陽性或多系統(tǒng)肺外表現(xiàn)，如晨僵、雷諾現(xiàn)象、干燥癥狀等，而根據(jù)這些血清學(xué)自身抗體和(或)臨床表現(xiàn)，又難以確診某一既定的CTD[14]。由于ILD是影響CTD預(yù)后的重要因素，及時準(zhǔn)確地在IPAF患者中識別出CTD，是治療成功的關(guān)鍵。

BALF檢查是獲取下呼吸道炎癥細(xì)胞及分泌物的安全、有效的方法，在CTD-ILD診斷中得到廣泛應(yīng)用，但未見BALF在IPAF中應(yīng)用的報道。CTD-ILD的肺損傷與炎癥細(xì)胞、免疫細(xì)胞在下呼吸道聚集導(dǎo)致肺泡炎有關(guān)，之后發(fā)展為肺泡間質(zhì)結(jié)構(gòu)不可逆的破壞，出現(xiàn)臨床ILD的表現(xiàn)，所以肺泡炎是ILD始動的最早期的異常。Otylia等[15]認(rèn)為，BALF肺泡炎尤其是中性粒細(xì)胞肺泡炎與影像學(xué)更嚴(yán)重的肺部間質(zhì)改變有關(guān)。Strange等[16]報道132例HRCT表現(xiàn)為磨玻璃影的系統(tǒng)性硬化癥相關(guān)ILD，其中86例(65%)BALF檢查具有肺泡炎改變，尤其是中性粒細(xì)胞肺泡炎。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)研究[17]證實(shí)BALF的中性粒細(xì)胞肺泡炎與HRCT中ILD的嚴(yán)重程度有關(guān)，但淋巴細(xì)胞與HRCT是否出現(xiàn)ILD無關(guān)。PM/DM的研究[18]也有類似的結(jié)果：50%～100%PM/DM相關(guān)ILD患者的BALF表現(xiàn)為中性粒細(xì)胞和(或)淋巴細(xì)胞升高。而干燥綜合征的研究[19]結(jié)果則有所不同：BALF以淋巴細(xì)胞升高最常見，占44%～55%；中性粒細(xì)胞升高不常見，占4%～17%；而嗜酸性粒細(xì)胞比例多正常。本研究觀察到CTD-ILD患者BALF的中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)較IPAF顯著增高。鑒于中性粒細(xì)胞肺泡炎在多種CTD-ILD中存在，我們認(rèn)為BALF出現(xiàn)中性粒細(xì)胞升高可能是CTD-ILD區(qū)別于IPAF的一個特異性表現(xiàn)。

本研究結(jié)果還顯示，IPAF和CTD-ILD均以女性多見，男女構(gòu)成比2組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IPAF與CTD-ILD臨床表現(xiàn)相似，呼吸系統(tǒng)主要癥狀為咳嗽、咳痰、呼吸困難，肺外多系統(tǒng)癥狀主要為干燥癥狀、關(guān)節(jié)癥狀、皮膚表現(xiàn)、肌痛及無力。CTD-ILD組46%(13/28)存在皮膚表現(xiàn)，多于IPAF組的11%(2/19)(P=0.010)。這些皮膚表現(xiàn)包括Gottron征或技工手9例，眼瞼紫紅色皮疹2例，手指浮腫1例，遠(yuǎn)端指尖皮膚潰瘍1例，其中12例經(jīng)進(jìn)一步肌電圖或肌活檢等檢查診斷為肌炎/皮肌炎或系統(tǒng)性硬化癥，說明特征性皮膚表現(xiàn)在診斷CTD-ILD時具有一定的特異性。另外，53%(10/19)的IPAF有干燥癥狀，較CTD-ILD的18%(5/28)多(P=0.012)，但這些患者行淚腺分泌試驗(yàn)或唇腺活檢未能確診為干燥綜合征，說明干燥癥狀在診斷CTD-ILD方面缺乏特異性。2組肺功能、血清自身抗體及影像學(xué)表現(xiàn)均無顯著性差異，故依靠臨床表現(xiàn)、血清自身抗體及影像學(xué)檢查難以完全鑒別IPAF與CTD-ILD。外科肺活檢可為是否存在CTD提供線索，但是該檢查創(chuàng)傷大，風(fēng)險高，臨床上很難被患者接受。本研究47例均未接受外科肺活檢。

本研究具有一定的局限性，由于肺部感染時BALF的中性粒細(xì)胞百分比可明顯升高，可能影響研究結(jié)果，故入組時嚴(yán)格篩選并排除感染的患者(結(jié)合臨床及病原學(xué)檢查等)，其結(jié)果導(dǎo)致本研究入組例數(shù)較少。尚需大樣本前瞻性研究進(jìn)一步明確BALF在CTD-ILD和IPAF中的異同及其與疾病預(yù)后的關(guān)系。

綜上所述，本研究中，我們觀察到CTD-ILD組BALF的中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)較IPAF顯著增高，其可能是CTD-ILD區(qū)別于IPAF的特異性表現(xiàn)。由于經(jīng)支氣管鏡檢查獲得BALF的方法操作簡便，安全性好，易于開展，因此，BALF在早期識別CTD-ILD和IPAF患者、指導(dǎo)臨床治療可能具有重要的意義，值得深入探討。

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