閆磊，黃天明，羅國容

(1牡丹江醫(yī)學院，黑龍江牡丹江157011；2廣西醫(yī)科大學)

研究發(fā)現(xiàn)，人類動力素蛋白(kinectin)可能存在8個選擇拼接區(qū)(V1～V8)，其中V4選擇拼接區(qū)所對應的氨基酸序列為3 278～3 364 bp，其拼接方式的不同可產(chǎn)生多種功能不同的kinectin異構體。2015年1月～2016年12月，我們采用RT-PCR法檢測kinectin基因V4L異構體在人肝癌組織與癌旁組織、正常肝組織中表達的差異性，為探索V4L異構體與肝癌發(fā)生、kinectin抗體的產(chǎn)生是否存在關聯(lián)提供一個新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料 經(jīng)廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會許可，于醫(yī)院肝膽外科收集45例肝癌患者的癌組織標本、配對癌旁組織及血清標本，10例正常肝組織標本取自肝囊腫、肝外傷患者。肝癌患者中男39例、女6例，年齡32～75歲，術前均未行任何抗腫瘤治療。胎牛血清、胰蛋白酶、TRIzol Reagent(美國Gibco公司)；DMEM/F12培養(yǎng)基、D-Hank′s液(美國Hyclone公司)；系統(tǒng)多通道PCR儀(MJPT-220)、Gel Doc 2000凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.2 kinectin基因V4L異構體檢測方法 采用RT-PCR法。根據(jù)GenBank人類kinectin全長序列中V4選擇拼接區(qū)的序列，應用Primer5設計引物，設計的引物跨越V4區(qū)，可得到2個目的片段：V4L(包含V4選擇拼接區(qū)的長kinectin 異構體)、V4S(不包含V4選擇拼接區(qū)的短kinectin 異構體)。引物由上海捷瑞基康生物技術有限公司合成，V4上游引物5′-TTAGATTCTTTGAAGGATGCAGTTGA-3′、下游引物5′-AGATCGTTCCATCTCTGCCTTTTC-3′，擴增片段長度621 bp(V4L)、534 bp(V4S)；內參照β-actin上游引物5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3′、下游引物5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′，擴增片段長度225 bp。采用TRIzol試劑一步法提取組織RNA，逆轉錄合成cDNA，進行PCR 擴增。PCR反應體系(25 μL): 去離子水9.5 μL，10×Master Mix 12.5 μL，上下游引物(20 pmol/μL)各0.5 μL，模板cDNA 2.0 μL。PCR反應參數(shù)：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色后用Bio-Rad 凝膠成像儀成像，用凝膠成像分析系統(tǒng)觀察并分析結果。用美國Bio-Rad凝膠成像分析系統(tǒng)對電泳條帶進行灰度掃描，以Quantity One軟件計算V4L/β-actin、V4S/β-actin，從而得出2種目的基因的相對含量，以V4L/V4S表示kinectin基因V4L異構體的相對表達量。

1.3 肝癌患者血清kinectin抗體檢測方法 采用ELSIA法。用包被緩沖液將MBP-kinectin稀釋至5.0 μg/mL，取100 μL/孔包被酶標板，4 ℃濕盒過夜。5%脫脂奶(300 μL/孔)37 ℃封閉1 h后，陽性對照和空白對照加入待檢稀釋血清(1∶16)各100 μL/孔，37 ℃濕盒孵育2 h。加入Biotin-綿羊抗人IgG單克隆抗體(1∶5 000)，37 ℃濕盒溫育2 h，1×PBS-T洗板5次。加入streptavidin-HRP(1∶4 000)，37 ℃濕盒溫育1 h，1×PBS-T洗板4次。TMB避光顯色20 min，加1 mol/L的H2SO4終止反應，酶標儀波長450 nm處讀取OD值?？瞻讓φ沼肞BS代替血清，其余步驟同上。血清kinectin抗體水平以滴度表示。

2 結果

2.1 不同肝組織中kinectin基因V4L異構體表達情況比較 肝癌組織中kinectin基因V4L/V4S為2.709±1.025，癌旁組織中為1.564±0.357，正常肝組織為1.507±0.499；經(jīng)兩兩比較，肝癌組織中V4L/V4S高于癌旁組織和正常肝組織，差異有統(tǒng)計學意義(F=29.698，P=0.000)。

2.2 肝癌患者血清kinectin抗體與肝癌組織中kinectin基因V4L異構體表達的關系 肝癌患者血清kinectin抗體滴度值為0.170 7±0.023 1，與肝癌組織中kinectin基因V4L/V4S不相關(r=-0.410，P>0.05)。

3 討論

kinectin是一種與囊泡轉運相關的膜受體蛋白，主要定位于內質網(wǎng)膜上。人的kinectin基因由46個外顯子共4 816個核苷酸組成，開放閱讀框位于188～4 258核苷酸處[1]。kinectin基因上可能存在多個選擇拼接區(qū)，可通過構成多種不同的選擇拼接異構體蛋白而行使不同的功能[2]。選擇性拼接是一種常見的真核生物hnRNA轉錄后加工的方法[3,4]。很多研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中某些基因選擇性拼接發(fā)生異常改變，導致該基因選擇性拼接異構體出現(xiàn)過度表達或表達降低促使腫瘤發(fā)生[5,6]。V4選擇拼接區(qū)包含87個堿基對，其缺失將導致29個氨基酸的缺失，V4選擇拼接區(qū)拼接方式的不同可能產(chǎn)生不同的kinectin異構體。不同的kinectin異構體有不同的功能，其比例平衡維持著kinectin的正常生理功能；而異構體之間的比例失調，將可能導致kinectin的正常生理功能發(fā)生紊亂，從而導致細胞病變[7～12]。

本研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌組織中kinectin基因V4L異構體表達高于癌旁組織和正常肝組織，這表明V4L異構體在肝癌組織中過度表達，可能與肝癌發(fā)生存在關聯(lián)。在正常肝組織中kinectin占優(yōu)勢地位的異型體為V4S，即V4選擇拼接區(qū)被剪接掉的kinectin異構體；而當kinectin基因選擇性拼接的調控機制發(fā)生異常時，可能使V4選擇拼接區(qū)的選擇性拼接發(fā)生相應的改變，導致V4L異構體過量表達，使kinectin異構體之間的比例發(fā)生改變，進而影響了kinectin的正常生理功能從而導致細胞病變。有學者[5]推斷，肝癌患者血清中kinectin抗體產(chǎn)生的機制，可能與V4L異構體過度增殖并且發(fā)生抗原性改變而被免疫系統(tǒng)識別有關。本研究對肝癌組織kinectin基因V4L/V4S與血清中kinectin抗體滴度值進行比較，尚未發(fā)現(xiàn)兩者之間具有相關性，未證實該學者的觀點?？赡茉蛉缦拢孩賯€別肝癌患者可能會出現(xiàn)免疫耐受[13～15]，免疫活性細胞接觸V4L異構體后表現(xiàn)出特異性的無應答狀態(tài)，不產(chǎn)生抗體；②抗體產(chǎn)生的階段性；③本實驗樣本數(shù)量只有45例，在相關分析時，樣本量過少。kinectin抗體的產(chǎn)生機制還比較復雜，有待進一步研究，今后將增大樣本量繼續(xù)進行探索。

目前，關于kinectin選擇拼接區(qū)的研究在國內外還很少，處于剛剛起步階段。隨著研究的不斷深入，將可能闡明kinectin作為肝癌相關抗原的機制，為其進一步開發(fā)與應用奠定基礎。

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