陳穎,劉鑫慧,畢芳芳,楊清

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院, 沈陽110004)

卵巢癌(OC)是女性常見惡性腫瘤之一，發(fā)病率及病死率高。美國癌癥協(xié)會預(yù)計，2018年美國將新增卵巢癌病患22 240例，死亡病患14 070例[1]。在中國據(jù)估計,2015年全國卵巢癌新發(fā)病例約5.21萬例,死亡病例約2.25萬例[2]。上皮性卵巢癌(EOC)是卵巢癌中最常見的病理類型，其中卵巢高級別漿液性癌(HGSC)占70%。雖然近年HGSC治療取得一定進展，但病死率仍較高，其中腫瘤發(fā)生浸潤轉(zhuǎn)移是其重要原因之一[3]。多發(fā)性骨髓瘤SET結(jié)構(gòu)域蛋白(MMSET)是一種組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶。MMSET主要在睪丸、胸腺及高度增殖的胚胎組織中表達，與人類胚胎發(fā)育等生理過程密切相關(guān)[4]。近年來研究表明，MMSET還與人類多種腫瘤的形成相關(guān)。研究者陸續(xù)在宮頸癌、頭頸部癌等多種癌組織中發(fā)現(xiàn)MMSET過表達[5,6]，但國內(nèi)外關(guān)于MMSET在卵巢癌中的研究仍較少。2017年9月～2018年2月，我們檢測了HGSC癌組織中MMSET表達，并探討其對卵巢癌細胞侵襲遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 收集本院2016年12月～2017年5月手術(shù)患者的卵巢高級別漿液性腺癌組織45例份，入組患者年齡37～68(53.7±8.64)歲。病理類型均為高級別漿液性癌，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者11例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者34例，F(xiàn)IGO分期Ⅰ～Ⅱ期者16例，Ⅲ～Ⅳ期者29例，腹水量>500 mL者16例，≤500 mL者29例，腫瘤直徑>10 cm者17例，≤10 cm者28例，CA125水平>300 U/mL者25例，≤300 U/mL者20例。正常卵巢組織27例份，因子宮內(nèi)膜病變行全子宮雙附件切除患者的正常卵巢組織，病理證實無卵巢病變，年齡40～70(52.09±5.11)歲。所有病患術(shù)前無放化療、服用激素等治療史，無其他干擾實驗結(jié)果的病癥。標(biāo)本留取符合倫理。卵巢癌細胞系OVCAR3及CAOV3購自上海中科院。TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑、SBYR等購自大連Takara公司。PubMed網(wǎng)站設(shè)計并驗證引物后由南京金斯瑞生物科技公司合成。一抗MMSET及GAPDH購自武漢Proteintech公司，山羊抗鼠二抗及山羊抗兔二抗購自北京中杉金橋公司。胰酶、1640培養(yǎng)基及胎牛血清購自美國HyClone公司；二甲基亞砜(DMSO)購自美國Solarbio公司；Lipo3000購自美國Invitrogen公司；細胞培養(yǎng)瓶、PBS、Transwell小室、Matrigel基質(zhì)膠購于美國Corning公司；MMSET siRNA購自上海吉瑪基因公司。

1.2 MMSET mRNA表達檢測 采用RT-PCR法。按照Takara公司TRIzol試劑說明書提取RNA，根據(jù)RNA沉淀量大小加入適量DEPC水。檢測提取的RNA樣品濃度及純度。取濃度及純度達標(biāo)的樣品按相應(yīng)步驟進行逆轉(zhuǎn)錄及擴增。相對定量法檢測目的基因表達。MMSET正向引物：5′-TGTGTGAGCTGCCATGCTTCCA-3′,反向引物：5′-TGAGCATCCTGCTGCCAGACAA-3′；GAPDH正向引物：5′-GTCTCCTCTGACTTCCAACAGCG-3′,反向引物：5′-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3′。

1.3 MMSET蛋白表達檢測 采用Western blotting法。剪取凍存的組織約20 mg，加入100 μL RIPA對組織進行裂解，靜置30 min。待組織裂解充分后，14 000 g，4 ℃離心30 min，取上清蛋白原液。BCA法定蛋白，余樣品與5×loading Buffer以4∶1的比例混勻并加熱變性(100 ℃ 5 min)，配制5%濃縮膠及10%分離凝膠跑電泳，上樣量30 μg。轉(zhuǎn)完膜后將目的條帶及內(nèi)參條帶膜置于5%脫脂奶粉中封閉2 h，后加入成比例稀釋的一抗，4 ℃冷房搖床過夜。12 h后洗膜并加入二抗，室溫下孵育2 h，ECL發(fā)光。采用Image J軟件對條帶的灰度值分析。

1.4 細胞培養(yǎng)與實驗分組 人卵巢癌細胞系CAOV3及OVCAR3按RPMI1640+10%胎牛血清(FBS)+1%雙抗(100 U/mL青霉素，100 U/mL鏈霉素)配制的培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)環(huán)境37 ℃、5%CO2。實驗分2組，si-NC組及si-MMSET組。si-NC組轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒，si-MMSET組轉(zhuǎn)染靶基因質(zhì)粒。

1.5 siRNA的合成、設(shè)計與轉(zhuǎn)染 siRNA由上海吉瑪基因公司合成，si-MMSET正向引物：5′-GCACUUCCAGGAUAUCAUUTT-3′,反向引物：5′-AAUGAUAUCCUGGAAGUGCTT-3′;si-NC正向引物：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′,反向引物：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。接種細胞于6孔板內(nèi)貼壁生長至密度達到50%～70%進行轉(zhuǎn)染，按說明書混合Lipo3000和siRNA,靜置20 min后進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染6 h后將無血清培養(yǎng)基換為完全培養(yǎng)基。48 h后應(yīng)用Western blotting法檢測轉(zhuǎn)染效果。

1.6 劃痕面積測算 鋪卵巢癌細胞CAOV3及OVCAR3于6孔板內(nèi)，細胞融合至70%左右時進行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染6 h后使用20 μL的滅菌槍頭垂直于孔板平面進行劃痕，洗去離壁的細胞，加入含2%血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)。此時定為劃痕0 h，分別于0、48 h于倒置顯微鏡下拍照記錄劃痕變化。并用Image J軟件計算劃痕面積，用48 h劃痕面積除以0 h劃痕面積，計算出劃痕面積的變化率。

1.7 穿膜細胞數(shù)測算 進行Transwell實驗。無血清培養(yǎng)基稀釋Matrigel膠(8∶1)包被小室置于24孔板中，孵箱內(nèi)過夜。細胞轉(zhuǎn)染24 h后用胰酶消化并用無血清培養(yǎng)基制成細胞懸液，每個小室上加入約104個細胞，終體積200 μL，下室加入完全培養(yǎng)基500 μL，37 ℃孵育48 h。棄掉小室下室的培養(yǎng)基，95%乙醇固定細胞，約15 min，結(jié)晶紫細胞染色，約20 min。使用倒置顯微鏡于4個不同的視野拍照記錄穿膜細胞數(shù)，取均值。

1.8 卵巢癌細胞CAOV3及OVCAR3中P-AKT、AKT蛋白表達檢測 采用Western blotting法。接種卵巢癌細胞CAOV3及OVCAR3于6孔板內(nèi)，貼壁生長至密度達到50%～70%進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞，用Western blotting法檢測siMMSET后卵巢癌細胞P-AKT、AKT蛋白表達。

2 結(jié)果

2.1 MMSET在HGSC癌及正常卵巢組織中表達比較 HGSC癌及正常卵巢組織中MMSET mRNA相對表達量分別為2.601 0±0.3145、1.121 0±0.097 7，二者比較，P<0.05。HGSC癌及正常卵巢組織中MMSET 蛋白相對表達量分別為0.942 5±0.076 6、0.616 6±0.063 7，二者比較P<0.05。

2.2 MMSET表達與HGSC患者臨床病理特征的關(guān)系 HGSC患者有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者卵巢組織中MMSET mRNA的相對表達量分別為5.107±2.068、2.262±0.264，二者比較，P<0.05；腹水量≤500 mL與>500 mL者卵巢組織中MMSET mRNA的相對表達量分別為2.290±0.293、4.676±1.457，二者比較，P<0.05；CA125≤300 U/mL與>300 U/mL患者卵巢組織中MMSET mRNA的相對表達量分別為1.756±0.268 1、3.244±0.480 8，二者比較，P<0.05；年齡≤55歲、>55歲卵巢組織中MMSET mRNA的相對表達量分別為2.421±0.468、3.760±1.021，二者比較，P>0.05；FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期患者MMSET mRNA的相對表達量分別為2.467±0.441、3.397±0.827，二者比較，P>0.05；腫瘤直徑≤10 cm及>10 cm患者MMSET mRNA的相對表達量分別為2.836±0.423、3.392±1.272，二者比較，P>0.05。

2.3 轉(zhuǎn)染后卵巢癌細胞中MMSET表達變化 si-NC組及si-MMSET組CAOV3卵巢癌細胞MMSET相對表達量分別為0.958 6±0.1472、0.445 4±0.051 6，OVCAR3卵巢癌細胞MMSET相對表達量分別為0.830 7±0.079 6、0.530 4±0.067 0，兩組比較，P均<0.05。

2.4 MMSET基因沉默后卵巢癌細胞遷移能力比較 48 h后卵巢癌細胞CAOV3 si-NC組及si-MMSET組的劃痕面積變化率分別為47.21%±5.38%、22.22%±6.20%，兩組比較，P<0.05；卵巢癌細胞OVCAR3 si-NC組及si-MMSET組的劃痕面積變化率分別為57.52%±2.76%、28.03%±2.48%，兩組比較，P<0.05。

2.5 MMSET基因沉默后卵巢癌細胞侵襲能力比較 Transwell小室實驗結(jié)果顯示，卵巢癌細胞CAOV3 si-NC組及si-MMSET組的穿膜細胞數(shù)分別為(27±4)、(10±2)個，卵巢癌細胞OVCAR3 si-NC組及si-MMSET組的穿膜細胞數(shù)分別為(70±5)、(33±3)個，兩組比較，P均<0.05。

2.6 MMSET基因沉默后卵巢癌細胞中P-AKT蛋白表達比較 si-NC組及si-MMSET組卵巢癌細胞CAOV3中P-AKT蛋白相對表達量分別為0.457 1±0.152 8、0.223 9±0.121 0，卵巢癌細胞OVCAR3中P-AKT蛋白相對表達量分別為0.6570±0.1068、0.439 9±0.100 2，兩組比較，P均<0.05。

3 討論

HGSC惡性度極高，患者5年存活率低于50%[7]。研究表明，表觀遺傳學(xué)的改變是影響腫瘤發(fā)生的重要因素之一。其中，組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶是抗癌治療的重要靶點，因其酶活性能得到有效控制。MMSET屬于組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶家族的一員，其SET結(jié)構(gòu)域具有催化能力，能使得H3K36二甲基化。MMSET表達與人類胚胎發(fā)育過程密切相關(guān)，MMSET基因缺陷會導(dǎo)致以生長發(fā)育遲緩、先天性心臟缺陷為病理特征的Wolf-Hirschhorn綜合征的發(fā)生[8]。MMSET的致癌作用最早見于多發(fā)性骨髓瘤，(4;14)(p16;q32)易位導(dǎo)致MMSET基因過表達[9]。

本研究結(jié)果顯示，MMSET在HGSC癌組織中過表達且與腹水量、CA125水平及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。該結(jié)果與Yang等[10]研究結(jié)果基本一致。查閱近年來國內(nèi)外相關(guān)文獻表明，過表達的MMSET能促進前列腺癌、骨肉瘤等多種腫瘤的侵襲遷移進程[11]。然而，關(guān)于MMSET是否參與卵巢癌細胞的侵襲遷移進程目前尚不清楚。為探究MMSET對卵巢癌細胞侵襲遷移的影響，本研究通過Transwell小室實驗及劃痕實驗分別測定了MMSET基因下調(diào)后卵巢癌細胞侵襲遷移能力的變化。結(jié)果表明，MMSET下調(diào)后細胞的侵襲遷移能力顯著降低?？梢奙MSET在卵巢癌細胞的侵襲遷移中起到重要作用，然而關(guān)于MMSET調(diào)控卵巢癌細胞侵襲遷移的具體機制目前尚未深入研究。Lu等[11]在骨肉瘤中同樣發(fā)現(xiàn)上調(diào)的MMSET基因能促進骨肉瘤細胞的侵襲遷移進程，且該過程可能是通過抑制E-cadherin表達實現(xiàn)。異常表達的miRNAs在癌癥細胞的起始、進展和轉(zhuǎn)移過程起重要作用。

AKT信號通路作為原癌基因通路在包括卵巢癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤中處于激活狀態(tài)，且過度激活的AKT信號通路與卵巢癌的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移、細胞周期進程、血管形成及耐藥等惡性行為密切相關(guān)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)基因沉默卵巢癌細胞中MMSET表達后，P-AKT蛋白表達隨之減少，表明MMSET可能是通過磷酸化激活A(yù)KT信號通路參與卵巢癌的發(fā)展進程，該結(jié)果與Li等[13]研究結(jié)果相符。此外，Li等[13]研究還表明MMSET與PI3K/AKT通路間存在相互調(diào)控的環(huán)路關(guān)系。然而在卵巢癌中是否存在該調(diào)控環(huán)路尚需進一步實驗驗證。

綜上所述，MMSET在HGSC中過表達，過表達的MMSET與卵巢癌患者的腹水量、CA125水平、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征及卵巢癌細胞的侵襲遷移能力相關(guān)，且MMSET可能通過調(diào)控AKT信號通路來參與卵巢癌的惡性進程。