金納米星/雙錐的可控制備、光熱轉(zhuǎn)換及體外光熱治療

吳 頔，樊 淼，張露云，邢晶晶，呂樹芳，曾樂勇

(河北大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002)

1 引 言

惡性腫瘤疾病嚴(yán)重威脅人類的健康和生命，具有侵襲性強(qiáng)、易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、預(yù)后差等缺點(diǎn)，給患者造成巨大的經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)。分子影像和分子探針技術(shù)的進(jìn)步和發(fā)展，對實(shí)現(xiàn)惡性腫瘤的精準(zhǔn)診療意義重大。與傳統(tǒng)的手術(shù)、放療、化療方法相比，光熱治療(PTT)是一種無創(chuàng)、局部、安全的光學(xué)治療方法，它利用納米探針材料的光熱轉(zhuǎn)換性能，可以將光能轉(zhuǎn)變?yōu)闊崮芟诎┘?xì)胞，具有治療程序簡便、治療時間短、恢復(fù)速度快等優(yōu)點(diǎn)，在惡性腫瘤的治療中具有重要的應(yīng)用前景[1-3]。

目前，用于腫瘤PTT的納米探針材料主要包括貴金屬納米材料、碳基/銅基等無機(jī)納米材料以及有機(jī)材料等[4-10]。由于材料的光轉(zhuǎn)換效率局限，通常需要提高光輻照通量以及光輻照時間才能發(fā)揮其優(yōu)異的PTT性能。然而，過高能量的激發(fā)光會引起組織非特異性“熱損傷”，熱效應(yīng)大。因此，尋找生物相容性好、光熱轉(zhuǎn)換效率高的納米探針材料是實(shí)現(xiàn)其安全治療的前提。金納米材料具有特殊的表面等離子體共振(SPR)性質(zhì)，具有毒性低、水溶性好及表面易官能化等優(yōu)點(diǎn)[11-12]。特別是金納米星和金納米雙錐，其在近紅外區(qū)的吸收光譜可連續(xù)調(diào)控，光熱轉(zhuǎn)換效率較高，是一類具有潛在應(yīng)用前景的PTT用納米探針材料[13-14]。金納米星和金納米雙錐的形貌具有明顯差異，根據(jù)材料的形貌-結(jié)構(gòu)-性能之間的構(gòu)效關(guān)系，其在同等條件下的光熱轉(zhuǎn)換以及光熱治療性能應(yīng)該與形貌具有對應(yīng)關(guān)系。然而，到目前為止仍沒有關(guān)于金納米星和金納米雙錐光熱性能的定量對比研究。因此，系統(tǒng)研究金納米星和金納米雙錐的可控制備，并評價其光熱性能和生物相容性，對實(shí)現(xiàn)它們在腫瘤安全、高效PTT中的應(yīng)用具有重要的意義。

本文采用種子生長法，合成出了金納米星和金納米雙錐材料，利用透射電子顯微鏡(TEM)、紫外-可見(UV-Vis)分光光度計(jì)對金納米星和金納米雙錐的形貌和SPR吸收性質(zhì)進(jìn)行了表征；評價了它們在808 nm激光輻照下的光熱性能，并計(jì)算了光熱轉(zhuǎn)換效率；最后，以人乳腺癌細(xì)胞MCF-7為對象，研究了金納米星和金納米雙錐的生物相容性和體外PTT性能。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 試劑與儀器

主要試劑：氯金酸(HAuCl4，98%)和十六烷基三甲基溴化胺(CTAB，99%)購自薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司，檸檬酸鈉(Alfa Aessar，99%)、硝酸銀(AgNO3，Alfa Aessar，99%)和抗壞血酸(Alfa Aessar，99%)購自北京伊諾凱科技有限公司，鹽酸(HCl，AR)購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，羧基巰基聚乙二醇(SH-PEG-COOH，MW=1 000)和3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物(MTT，>98%)購自上海索寶生物科技有限公司。

主要儀器：TEM(FEI Tecnai F20)、UV-Vis分光光度計(jì)(PerkinElmer Lambda 35)、紅外熱成像儀(武漢奧斯特光電，MAG-V30)、酶標(biāo)儀(thermal Fisher,FC)、磁力攪拌器(德國IKA，RCT Basic)、高速離心機(jī)(上海安亭，TGL-15B)。

2.2 金納米星和金納米雙錐的制備

2.2.1 金納米星的制備

向裝有49 mL水的燒瓶中加入1 mL的HAuCl4(50 mmol/L)溶液，加熱煮沸；然后向其中加入7.5 mL的檸檬酸鈉(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%)溶液，繼續(xù)加熱煮沸15 min后，冷卻至室溫，即得到金種子溶液。向裝有15 mL水的燒杯中，依次加入100 μL 的HAuCl4(59 mmol/L)溶液、20 μL的HCl(1 mol/L)溶液和20 μL的金種子溶液；室溫?cái)嚢? min后，迅速向其中加入40 μL的AgNO3(10 mmol/L)溶液和100 μL的抗壞血酸(100 mmol/L)溶液；30 s后，向其中加入0.5 mL的SH-PEG-COOH(0.2 mmol/L)溶液，繼續(xù)攪拌30 min，離心收集，得到金納米星樣品。

2.2.2 金納米雙錐的制備

向裝有2 mL的HAuCl4(10 mmol/L)溶液的燒瓶中依次加入40 mL的CTAB(100 mmol/L)溶液和400 μL的AgNO3(10 mmol/L)溶液制成生長溶液；然后將800 μL的鹽酸(1 mol/L)溶液和100 μL的抗壞血酸(100 mmol/L)溶液加入到生長溶液中并持續(xù)攪拌；2 min后，取2.2.1中制備的金種子溶液280 μL加入到上述溶液中，將其在28 ℃水浴環(huán)境中靜置、保溫5 h；待溶液顏色變?yōu)榘底仙珪r，離心并用去離子水清洗，然后向其中加入2 mL的SH-PEG-COOH(0.2 mmol/L)溶液；繼續(xù)攪拌30 min，離心收集，得到金納米雙錐樣品。

2.3 光熱性能及光熱轉(zhuǎn)換效率

首先，研究納米粒子濃度對光熱性能的影響，分別將金納米星和金納米雙錐分散于去離子水中，配制成不同濃度的納米粒子溶液(0，20，40，60，80 μg/mL)；然后利用808 nm激光(功率密度2.0 W/cm2)對納米粒子溶液進(jìn)行輻照，輻照時間為5 min，利用紅外熱成像儀監(jiān)測溶液溫度的變化，并繪制出溫度隨時間的變化曲線。其次，研究激光功率密度對光熱性能的影響，取濃度為80 μg/mL的金納米星和金納米雙錐溶液，利用不同功率密度的808 nm激光(0，0.5，1.0，1.5，2.0 W/cm2)進(jìn)行輻照，輻照時間為5 min，利用紅外熱成像儀監(jiān)測溶液溫度的變化，并繪制出溫度隨時間的變化曲線。最后，研究金納米星和金納米雙錐的光熱轉(zhuǎn)換效率，利用紅外熱成像儀監(jiān)測納米粒子溶液經(jīng)808 nm激光(2.0 W/cm2)輻照5 min后的升溫和降溫情況。

2.4 細(xì)胞毒性及體外光熱治療

取對數(shù)生長期的人乳腺癌細(xì)胞MCF-7分別與不同濃度的金納米星和金納米雙錐溶液(0，20，40，60和80 μg/mL)共孵育24 h，考察不同濃度納米粒子對細(xì)胞存活率的影響。將不同濃度的金納米星和金納米雙錐溶液(0，20，40，60，80 μg/mL)分別與MCF-7細(xì)胞共孵育4 h，然后利用808 nm激光(功率密度2.0 W/cm2)進(jìn)行輻照5 min，繼續(xù)孵育20 h后，測定細(xì)胞存活率。將濃度為80 μg/mL的金納米星和金納米雙錐溶液分別與MCF-7細(xì)胞共孵育4 h，然后利用不同功率的808 nm激光(功率密度0.5，1.0，1.5，2.0 W/cm2)進(jìn)行輻照5 min，繼續(xù)孵育20 h后，測定細(xì)胞存活率。

3 結(jié)果與討論

3.1 金納米星和金納米雙錐的制備及表征

對合成的金納米星和金納米雙錐的形貌進(jìn)行了表征。如圖1(a)和(b)為金納米星的低倍和高倍TEM圖，可以看出金納米星分散性好、尺寸均一，具有明顯的針狀結(jié)構(gòu)，單個金納米星的尺寸約為100～150 nm。圖1(c)和(d)為金納米雙錐的TEM圖，可以看出金納米雙錐純度高、分散性好、尺寸分布均勻，單個金納米雙錐的長徑比約為10∶3(縱向長度約為100 nm，橫向?qū)挾燃s為30 nm)。

圖1 金納米星和金納米雙錐的TEM圖。(a),(b)金納米星的低倍和高倍TEM圖；(c),(d)金納米雙錐的低倍和高倍TEM圖。
Fig.1 TEM images of gold nanostars and gold nanobipyramids.(a),(b) Low-and high-magnification TEM images of gold nanostars.(c),(d) Low-and high-magnification TEM images of gold nanobipyramids.

金納米材料具有優(yōu)異的SPR性質(zhì)，其在近紅外波段的吸收是評價其近紅外光熱轉(zhuǎn)換以及光熱治療性能優(yōu)劣的關(guān)鍵。圖2(a)和(b)分別為金納米星和金納米雙錐的UV-Vis吸收光譜圖，從圖2(a)中可以看出，金納米星的中心吸收峰位于808 nm左右，其吸收峰較寬化，覆蓋600～1 000 nm范圍。在圖2(b)中，金納米雙錐具有兩個明顯的吸收峰，其中強(qiáng)度較低、位于518 nm左右的吸收峰對應(yīng)于金納米雙錐的橫向特征峰，強(qiáng)度較高、位于815 nm左右的吸收峰對應(yīng)于金納米雙錐的縱向特征峰；縱向與橫向特征峰強(qiáng)度比值越大，金納米雙錐的純度越高。在圖2(b)中，計(jì)算得到兩個特征峰的強(qiáng)度比值約為2.97，表明所合成的金納米雙錐具有較高的純度。由于合成的金納米星和金納米雙錐在808 nm附近均有特征吸收峰，因此可以用作近紅外響應(yīng)的光熱轉(zhuǎn)換材料。

圖2 金納米星和金納米雙錐的UV-Vis吸收光譜圖。(a)金納米星；(b)金納米雙錐。Fig.2 UV-Vis absorption spectra of gold nanostars and gold nanobipyramids.(a) Gold nanostars.(b) Gold nanobipyramids.

3.2 材料的光熱性能及光熱轉(zhuǎn)換效率計(jì)算

固定金納米星和金納米雙錐溶液的體積為2 mL，通過改變納米粒子濃度和808 nm激光輻照功率，研究了金納米星和金納米雙錐溶液的升溫情況。圖3(a)和(c)分別是不同濃度的金納米星和金納米雙錐溶液在808 nm激光(功率密度為2.0 W/cm2)輻照下的溫度變化情況。從圖中可知，隨著納米粒子濃度的提高，溶液的升溫越來越快；而在相同條件下，純水的溫度僅升高了4.19 ℃，表明808 nm激光的熱效應(yīng)小，對正常組織不具有熱損傷性。圖3(b)和(d)分別是濃度為80 μg/mL的金納米星和金納米雙錐溶液在不同功率808 nm激光輻照下的溫度變化情況?？梢钥闯觯S著輻照功率的增加，納米粒子溶液的升溫越來越快。當(dāng)金納米星和金納米雙錐的濃度為80 μg/mL時，在2.0 W/cm2的808 nm激光輻照下，金納米星和金納米雙錐溶液的溫度分別升高了35.50 ℃和42.88 ℃，表明金納米雙錐具有更優(yōu)異的光熱性能。

光熱轉(zhuǎn)換效率是評價一種材料光熱性能的重要指標(biāo)。在實(shí)驗(yàn)中，采用功率密度為2.0 W/cm2的808 nm激光，分別對2 mL的金納米星和金納米雙錐溶液照射5 min，同時監(jiān)測溶液的升溫和降溫情況，如圖4(a)和4(c)所示。根據(jù)文獻(xiàn)[15]報道的方法，材料的光熱轉(zhuǎn)換效率計(jì)算公式如下：

圖3 不同濃度和不同功率條件下，金納米星和金納米雙錐的溫度變化曲線。(a)，(b)金納米星；(c)，(d)金納米雙錐。
Fig.3 Temperature variation curves of gold nanostars and gold nanobipyramids under different concentration of nanomaterials and different power density of 808 nm laser.(a),(b) Gold nanostars.(c),(d) Gold nanobipyramids.

(1)

(2)

(3)

(4)

其中mi和Cp,i分別為溶液中不同物質(zhì)的質(zhì)量和比熱，ΔTmax為金納米星和金納米雙錐溶液在5 min內(nèi)溫度變化最大值，ΔTH2O為純水在5 min內(nèi)溫度變化最大值(可由圖3(a)得到)，I為808 nm激光功率密度，Aλ為金納米星和金納米雙錐的特征吸收峰強(qiáng)度值。為了計(jì)算出材料的光熱換換效率η，必須得出hA值，為此，根據(jù)圖4(a)和(c)可繪制出金納米星和金納米雙錐溶液在降溫階段時間(t)與-lnθ的關(guān)系曲線，如圖4(b)和4(d)，直線擬合后斜率分別為341.29和363.49。根據(jù)公式(4)可知，hA值與圖4(b)和(d)中的斜率負(fù)相關(guān)。在公式(4)中，納米粒子的質(zhì)量可忽略不計(jì)，僅考慮溶劑(2 mL水，質(zhì)量和比熱均已知)的質(zhì)量，則可求得金納米星和金納米雙錐的hA分別為0.024 6和0.023 1，將其代入公式(2)，得到金納米星和金納米雙錐的光熱轉(zhuǎn)換效率分別為48.43%和53.68%，表明金納米雙錐具有更高的光熱轉(zhuǎn)換效率。

圖4 金納米星和金納米雙錐的升溫/降溫曲線以及在降溫階段時間(t)與-lnθ之間的線性關(guān)系曲線。(a)，(b)金納米星；(c)，(d)金納米雙錐。
Fig.4 Heating/cooling curves and the linear relationship of time data (t)versus-lnθobtained from the cooling period.(a),(b) Gold nanostars.(c),(d) Gold nanobipyramids.

3.3 材料的細(xì)胞毒性及細(xì)胞光熱治療性能評價

材料的生物相容性評價是實(shí)現(xiàn)其體內(nèi)應(yīng)用的前提。在我們的實(shí)驗(yàn)中，將不同濃度的金納米星和金納米雙錐分別與人乳腺癌細(xì)胞MCF-7共孵育24 h，然后采用MTT方法對細(xì)胞存活率進(jìn)行表征。如圖5(a)所示，當(dāng)金納米星和金納米雙錐的濃度從0 μg/mL提高到80 μg/mL時，細(xì)胞存活率均在90%以上，表明金納米星和金納米雙錐均具有良好的生物相容性。

采用808 nm激光，研究了不同條件下金納米星和金納米雙錐對MCF-7細(xì)胞的光熱治療性能。圖5(b)是當(dāng)2.0 W/cm2的808 nm激光輻照5 min后，不同濃度的金納米星和金納米雙錐分別與MCF-7細(xì)胞共孵育后的細(xì)胞存活率?？梢园l(fā)現(xiàn)，隨著納米粒子濃度的提高，細(xì)胞存活率逐漸降低；而且，在相同條件下，金納米雙錐的光熱治療性能優(yōu)于金納米星。當(dāng)不同功率808 nm激光輻照5 min后，濃度為80 μg/mL的金納米星和金納米雙錐分別與MCF-7細(xì)胞共孵育后的細(xì)胞存活率如圖5(c)所示?？梢钥闯?，隨著輻照功率的提高，細(xì)胞存活率逐漸降低；而且，在相同條件下，金納米雙錐的光熱治療性能優(yōu)于金納米星。當(dāng)808 nm激光功率密度為2.0 W/cm2、納米粒子濃度為80 μg/mL時，金納米星和金納米雙錐孵育的MCF-7細(xì)胞存活率分別為22.54%和13.73%，表明金納米雙錐具有更加優(yōu)異的光熱治療性能。

圖5 金納米星和金納米雙錐的細(xì)胞毒性以及體外光熱治療性能。(a)細(xì)胞毒性；(b)不同濃度條件下的光熱治療性能；(c)不同激光功率密度條件下的光熱治療性能。
Fig.5 Cytotoxicity andinvitroPTT performance of gold nanostars and gold nanobipyramids.(a) Cytotoxicity.(b) PTT performance with different concentration of nanomaterials.(c) PTT performance with different power density of 808 nm laser.

4 結(jié) 論

本文采用種子生長法合成出了分散性好、尺寸均一、純度高的金納米星和金納米雙錐材料，金納米星尺寸約為100～150 nm，吸收峰位于808 nm左右；金納米雙錐的長徑比約為10∶3，縱向長度約為100 nm，縱向吸收峰位于815 nm左右。當(dāng)2.0 W/cm2的808 nm激光輻照5 min時，80 μg/mL的金納米星和金納米雙錐溶液的升溫可達(dá)35.50 ℃和42.88 ℃，光熱轉(zhuǎn)換效率分別為48.43%和53.68%，與MCF-7細(xì)胞共孵育后細(xì)胞存活率分別降至22.54%和13.73%。而且，在同等條件下，金納米雙錐的光熱性能優(yōu)于金納米星，是一種優(yōu)異的腫瘤PTT用納米探針材料。

[1] CHENG L,WANG C,FENG L Z,etal..Functional nanomaterials for phototherapies of cancer [J].Chem.Rev.,2014,114:10869-10939.

[2] SHANMUGAM V,SELVAKUMAR S,YEH C S.Near-infrared light-responsive nanomaterials in cancer therapeutics [J].Chem.Soc.Rev.,2014,43:6254-6287.

[3] ZOU L L,WANG H,HE B,etal..Current approaches of photothermal therapy in treatmenting cancer matastasis with nanotherapeeutics [J].Theranostics,2016,6:762-772.

[4] WANG C,BLACK K C L,LUEHMANN H,etal..Comparison study of gold nanohexapods,nanorods,and nanocages for photothermal cancer treatment [J].ACSNano,2013,7:2068-2077.

[5] ZHOU M,LI J J,LIANG S,etal..CuS nanodots with ultrahigh efficient renal clearance for positron emission tomography imaging and image-guided photothermal therapy [J].ACSNano,2015,9:7085-7096.

[6] LI C,KWON W,BEACK S,etal..Biodegradable nitrogen-doped carbon nanodots for non-invasive photoacoustic imaging and photothermal therapy [J].Theranostics,2016,6:2196-2208.

[7] 李奕杉,鐘年丙,廖強(qiáng),等.基于六硼化鑭與殼聚糖的光熱轉(zhuǎn)換生物材料 [J].發(fā)光學(xué)報,2017,38(8):1021-1027.

LI Y S,ZHONG B N,LIAO Q,etal..Photo-thermal biomaterials based on lanthanum hexaboride (LaB6) and chitosan [J].Chin.J.Lumin.,2017,38(8):1021-1027.(in Chinese)

[8] 李欣遠(yuǎn),紀(jì)穆為,王虹智,等.近紅外光熱轉(zhuǎn)換納米晶研究進(jìn)展 [J].中國光學(xué),2017,10(5):541-554.

LI X Y,JI M W,WANG H Z,etal..Research progress of near-infrared photothermal conversion nanocrystals [J].Chin.Opt.,2017,10(5):541-554.(in Chinese)

[9] ZHOU J,LU Z G,ZHU X J,etal..NIR photothermal therapy using polyaniline nanoparticles [J].Biomaterials,2013,34:9584-9592.

[10] ZOU Q L,ABBAS M,ZHAO L Y,etal..Biological photothermal nanodots based on self-assembly of peptide-porphyrin conjugates for antitumor therapy [J].J.Am.Chem.Soc.,2017,139:1921-1927.

[11] YANG X,YANG M X,PANG B,etal..Gold nanomaterials at work in biomedicine [J].Chem.Rev.,2015,115:10410-10488.

[12] DREADEN E C,ALKILANY A M,HUANG X H,etal..The golden age:gold nanoparticles for biomedicine [J].Chem.Soc.Rev.,2012,41:2740-2779.

[13] WANG S J,HUANG P,NIE L M,etal..Single continuous wave laser induced photodynamic/plasmonic photothermal therapy using photosensitizer-functionalized gold nanostars [J].Adv.Mater.,2013,25:3055-3061.

[14] FENG J,CHEN L M,XIA Y Z,etal..Bioconjugation of gold nanobipyramids for simultaneous SERS detection and targeted photothermal therapy in breast cancer [J].ACSBiomater.Sci.Eng.,2017,3:608-618.

[15] LIU Y,AI K,LIU J,etal..Dopamine-melanin colloidal nanospheres:an efficient near-infrared photothermal therapeutic agent forinvivocancer therapy [J].Adv.Mater.,2013,25:1353-1359.

吳頔(1984-)，女，遼寧撫順人，碩士，實(shí)驗(yàn)師，2010年于東北林業(yè)大學(xué)獲得碩士學(xué)位，主要從事納米材料制備及生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的研究。

E-mail:wudi2137@163.com

曾樂勇(1981-)，男，河北新河人，博士，研究員，2010年于中科院長春光機(jī)所獲得博士學(xué)位，主要從事無機(jī)納米探針制備及腫瘤可視化診療的研究。

E-mail:zenglyhbu@163.com