莊黎麗，王劍，楊志民

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

在干旱、高溫、低溫或高鹽等這些逆境非生物脅迫條件下，植物中很多脅迫響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了改變。一些轉(zhuǎn)錄因子在非生物脅迫響應(yīng)過程中起重要作用，是稱之為調(diào)節(jié)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的主要組分，調(diào)控植物下游靶標(biāo)基因的表達(dá)[1-2]。這些轉(zhuǎn)錄因子是對(duì)植物品種性狀進(jìn)行改良，提高其逆境脅迫下抗性的潛在工具[3-4]。例如，研究表明，過量表達(dá)脫水響應(yīng)元件結(jié)合蛋白(dehydration-responsive element binding，DREBs)，脫落酸響應(yīng)元件結(jié)合蛋白(ABA responsive element binding factors, AREBs)和NAM, ATAF1/2, CUC2 (NACs)等轉(zhuǎn)錄因子能夠產(chǎn)生抗逆性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因株系，且不影響產(chǎn)量[1-2]。然而，目前大部分轉(zhuǎn)錄因子參與非生物脅迫的功能研究仍然缺乏。

I類同源異型-亮氨酸拉鏈蛋白(class I homeodomain-leucine zipper, HD-Zip I)屬于高等植物所特有的HD-Zip家族的一個(gè)亞類，其序列包括一個(gè)高度保守的同源異型結(jié)構(gòu)域(homeodomian, HD)及一個(gè)位于HD下游的亮氨酸拉鏈(leucine zipper, LZ)結(jié)構(gòu)域[5]。在模式植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)和水稻(Oryzasativa)中分別有17和14個(gè)成員[5-8]。根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹，可劃分為8個(gè)進(jìn)化分枝[9-10]。HD-Zip I主要參與植物對(duì)生物和非生物等逆境脅迫因子的應(yīng)答反應(yīng)、激素和光信號(hào)應(yīng)答以及器官發(fā)育調(diào)控等過程[11]。例如，擬南芥HD-Zip I因子HB6為蛋白磷酸酶ABA-insensitive(ABI)的靶標(biāo)，調(diào)控脫落酸(ABA)信號(hào)響應(yīng)[12]，而HB7和HB12響應(yīng)脫落酸信號(hào)，調(diào)控水分缺失條件下的植物生長(zhǎng)[13]。月季(Rosachinensis)RhHB1參與ABA和乙烯對(duì)赤霉素氧化酶基因(RhGA20ox1)的抑制[14]。水稻中，HD-Zip I因子OsHOX12抑制赤霉素合成，調(diào)控水稻節(jié)間的伸長(zhǎng)[15]；OsHOX4則通過影響赤霉素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來調(diào)控植株高矮及分蘗數(shù)[16-17]，而OsHOX22和OsHOX24調(diào)控水稻的耐旱性及耐鹽性[18-19]。玉米(Zeamays)中HD-ZipI基因家族的成員Grassytillers1(GT1)抑制分蘗芽的伸長(zhǎng)[20]。大麥(Hordeumvulgare)中Six-rowedspike1 (VRS1)則調(diào)控花序的分枝發(fā)育[21]。擬南芥中3個(gè)GT1同源基因(HB21，HB40及HB53)促進(jìn)脫落酸的合成，從而抑制遮陰條件下腋芽的伸長(zhǎng)[22]。然而，即使在模式植物水稻、擬南芥中，目前對(duì)于HD-Zip I的功能研究主要集中在δ和γ進(jìn)化枝，其他分枝的較少涉及，而對(duì)于非模式植物中HD-Zip I的功能，研究更少。

高羊茅(Festucaarundinacea)為禾本科羊茅屬多年生草本植物，是優(yōu)良的冷季型草種，具有生長(zhǎng)迅速、再生性強(qiáng)、耐濕耐熱、耐瘠薄、抗病、適應(yīng)性廣等特點(diǎn)，在氣候過渡地帶城市綠化及人工草地建植中廣泛應(yīng)用[23-26]。然而，在高羊茅的整個(gè)生命周期中，經(jīng)常遭遇極端高溫、寒冷、干旱等逆境脅迫，制約高羊茅的生長(zhǎng)發(fā)育，造成綠地景觀效果變差或草地生產(chǎn)力下降。因此，培育抗旱耐極端溫度的品種，有助于提高高羊茅的抗逆能力。隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因育種因其準(zhǔn)確、直接、高效的優(yōu)勢(shì)，將成為重要的生物育種手段[27-28]。優(yōu)異的基因資源則為轉(zhuǎn)基因育種提供分子基礎(chǔ)。然而長(zhǎng)期以來，對(duì)于高羊茅等草類植物的研究多集中在種質(zhì)資源收集及生理評(píng)價(jià)，對(duì)分子機(jī)理的研究比較缺乏。這主要是由于高羊茅缺乏全基因組參考序列導(dǎo)致的。高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，為高羊茅等無參考序列物種的分子生物學(xué)研究提供了豐富的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)[29-31]。目前已有多個(gè)物種通過分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)得到了較為理想的轉(zhuǎn)錄因子家族序列的信息，如菊花(Dendranthemamorifolium)和茶樹(Camelliasinensis)中SBP-like、DOF、Trihelix和NAC轉(zhuǎn)錄因子家族的分析及鑒定[32-35]。這說明非模式植物中基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)分析和鑒定重要的轉(zhuǎn)錄因子家族成為可能?；诖耍狙芯繑M在高羊茅轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)的基礎(chǔ)上，分析和鑒定高羊茅HD-Zip I轉(zhuǎn)錄因子家族，并對(duì)其結(jié)構(gòu)特征及干旱脅迫下的表達(dá)模式進(jìn)行分析，以期為研究高羊茅中轉(zhuǎn)錄因子家族的功能提供一種新的思路和前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料與生長(zhǎng)條件

本研究選擇經(jīng)典的高羊茅品種‘Kentucky-31’(K-31)為研究材料。2017年1月，將K-31種子放置在鋪兩層濾紙的培養(yǎng)皿中，加入適量自來水，放置于4 ℃冰箱春化3 d，隨后將培養(yǎng)皿置于光照培養(yǎng)箱萌發(fā)。將萌發(fā)10 d的小苗轉(zhuǎn)移到人工氣候室進(jìn)行水培培養(yǎng)，一共培養(yǎng)9桶材料。培養(yǎng)條件為：白天、夜晚各12 h，白天溫度25 ℃，夜晚溫度20 ℃，濕度70%，光照強(qiáng)度為500 μmol·m-2·s-1。將小苗根頸部位以海綿包裹，種植于打孔的黑色泡沫板上，根系浸入1/2霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液[36]，并且用增氧泵通氣。每隔3 d監(jiān)測(cè)一次營(yíng)養(yǎng)液pH值，每周換一次營(yíng)養(yǎng)液。

1.2 植物處理

2017年2月，對(duì)1/2霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液中水培培養(yǎng)的K-31植株進(jìn)行模擬干旱處理，具體方法為:將聚乙二醇6000(polyethylene glycol, PEG6000)加入營(yíng)養(yǎng)液中使其終濃度達(dá)到20%。短期干旱處理持續(xù)24 h，在20% PEG6000處理0, 3, 6, 12, 24 h時(shí)進(jìn)行取樣。長(zhǎng)期干旱在20% PEG6000處理7及14 d時(shí)取樣。取樣時(shí)，采取根頸在液氮中速凍，隨后保存在-70 ℃冰箱中。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)都選取處理植株及相應(yīng)的對(duì)照植株。對(duì)照組、短期干旱處理及長(zhǎng)期干旱處理分別處理3桶植株，取樣時(shí)均有3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.3 全長(zhǎng)高羊茅HD-Zip I (FaHD-Zip I) cDNA的數(shù)據(jù)庫(kù)搜索、克隆與測(cè)序

擬南芥HD-Zip I序列從http://www.arabidopsis.org/下載獲得。水稻HD-Zip I序列根據(jù)Agalou等[37]提供的登錄號(hào)，到NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得。將3個(gè)已發(fā)表[29-31]及本實(shí)驗(yàn)室兩個(gè)未發(fā)表的高羊茅轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)配置到BioEdit軟件的本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)中。以14個(gè)水稻HD-Zip I蛋白序列作為鑒定FaHD-Zip I的請(qǐng)求序列，采用‘tblastn’程序，選取E-10作為期望值，搜索本地高羊茅數(shù)據(jù)庫(kù)。所得序列到NCBI進(jìn)一步進(jìn)行blastX搜索比對(duì)，并且進(jìn)行拼接組裝，獲得候選FaHD-Zip I序列。根據(jù)預(yù)測(cè)cDNA的5′和3′端序列設(shè)計(jì)第1輪引物，根據(jù)開放閱讀框(open reading frame, ORF)設(shè)計(jì)第2輪引物。采用巢式PCR技術(shù)，通過Takara LA taq擴(kuò)增FaHD-Zip I的候選目的條帶。將擴(kuò)增條帶利用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒(Axygen)純化后，連接到pMD19-T，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證陽(yáng)性克隆后送上海生工測(cè)序。

1.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建及序列分析

采用MEGA 6.0軟件，用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。采用Compute pI/Mw在線工具預(yù)測(cè)高羊茅HD-Zip I蛋白的等電點(diǎn)(isoelectric point, pI)及分子量(molecular weight, Mw)，采用PSORT預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位，采用MEME program v4.10.2預(yù)測(cè)保守結(jié)構(gòu)域。MEME鑒定的所有結(jié)構(gòu)域均在SMART和Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行搜索。

1.5 熒光定量PCR (qRT-PCR)

采用植物RNA提取試劑盒提取樣品總RNA。取1 μg RNA進(jìn)行第一鏈cDNA的合成，所用試劑盒為PrimerScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)，反轉(zhuǎn)錄之前去除基因組DNA。所用定量PCR試劑為SYBR Green I Master reaction system。定量PCR的條件設(shè)置為：95 ℃預(yù)變性10 min，隨后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增(95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s)。每個(gè)循環(huán)都設(shè)定在65 ℃采集數(shù)據(jù)。內(nèi)參基因?yàn)镕aTublin[38]，每個(gè)生物學(xué)樣品都進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)，采用2-ΔΔCT法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0 (SPSS Inc, Chicago, IL, USA)軟件進(jìn)行方差分析并用SigmaPlot 12.5 (Systat Software, Inc, San Jose, CA, USA)繪圖，平均值采用最小顯著差異法(LSD)進(jìn)行多重比較，顯著水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 高羊茅HD-Zip I轉(zhuǎn)錄因子的鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化分析

采用14個(gè)水稻HD-Zip I蛋白序列(表1)作為搜索請(qǐng)求，在高羊茅本地轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索，經(jīng)分析、組裝和拼接，巢式PCR擴(kuò)增(引物序列見表2)，單克隆測(cè)序鑒定，得到13個(gè)高羊茅HD-Zip I全長(zhǎng)ORF序列(表1)?；谒镜拿Q(OsHOX)來命名高羊茅HD-Zip I序列(FaHOXs)，并且將其登錄到NCBI (GenBank登錄號(hào): MG189709～MG189721)。結(jié)果表明，13個(gè)FaHOX候選蛋白序列長(zhǎng)度從221(FaHOX24)到345(FaHOX16)個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)為4.66(FaHOX16)到6.32(FaHOX14)，分子質(zhì)量從24604.12(FaHOX24)到37611.29(FaHOX16)。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果表明，這13個(gè)FaHOX基因均定位在細(xì)胞核中，與其轉(zhuǎn)錄因子功能相吻合。

表1 FaHD-Zip I候選基因及其水稻同源序列概況Table 1 Summary of FaHD-Zip I sequence and the identity of likely O. sativa homologs

為了評(píng)價(jià)高羊茅、水稻及擬南芥中HD-Zip I蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，對(duì)所得高羊茅的氨基酸序列與水稻及擬南芥中蛋白進(jìn)行對(duì)比分析。采用鄰接法及靴值分析(1000次重復(fù))構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖1)。結(jié)果表明，植物HD-Zip I家族蛋白表現(xiàn)出極大的多樣性，可以分為8個(gè)進(jìn)化分枝，13個(gè)FaHOX蛋白及14個(gè)OsHOX蛋白均分布在α、β1、δ、γ、ζ這5個(gè)進(jìn)化枝，而雙子葉植物擬南芥除了沒有蛋白在ζ進(jìn)化枝分布，其他7個(gè)進(jìn)化枝均有分布。其中，β2、ε及φ1為雙子葉植物擬南芥特有。此外，從進(jìn)化樹可以看出，所有13個(gè)FaHOX蛋白均與相應(yīng)的水稻蛋白聚類在一起，表明其親緣關(guān)系非常接近。此外，高羊茅中未找到OsHOX23的同源蛋白(表1，圖1)。

2.2 FaHD-Zip I蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析

采用MEME軟件預(yù)測(cè)高羊茅及水稻HOX蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，一共鑒定到5個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域[結(jié)構(gòu)域?qū)挾仍O(shè)置為6～50個(gè)氨基酸殘基，E值(expectation value,期望值)小于1.8×10-45]，詳細(xì)信息見表3。結(jié)果表明，基于保守的氨基酸結(jié)構(gòu)域，可將高羊茅HOX基因劃分為5個(gè)亞類。結(jié)構(gòu)域1, 2, 3和4在FaHOX13, FaHOX8, FaHOX20和FaHOX4中同時(shí)出現(xiàn)，且排布方式一致。結(jié)構(gòu)域1, 2, 3在FaHOX6, FaHOX24和FaHOX22中排布方式一致。FaHOX12和FaHOX14均只有1和2兩個(gè)結(jié)構(gòu)域。FaHOX21與其他蛋白明顯不同，含有最多數(shù)量的結(jié)構(gòu)域，單獨(dú)成為一個(gè)亞族。其他HOX蛋白，如FaHOX25, FaHOX5以及FaHOX16，以結(jié)構(gòu)域5開頭，不同于其他亞族蛋白均是結(jié)構(gòu)域1在N端。此外，結(jié)果還表明，除了β1亞族的FaHOX5/OsHOX5，高羊茅中比水稻中多一個(gè)結(jié)構(gòu)域4，大部分高羊茅HOX蛋白與水稻HOX蛋白在結(jié)構(gòu)域的排布方式及數(shù)量上有很好的一致性(圖2)。

表2 FaHD-Zip I基因克隆用引物Table 2 Primers used for FaHD-Zip I cloning

2.3 短期干旱脅迫下FaHD-Zip I基因的表達(dá)

干旱脅迫是目前影響植物生長(zhǎng)最大的逆境條件之一，研究植物中耐旱因子有著重要的意義。采用qRT-PCR技術(shù)對(duì)20% PEG6000模擬干旱處理下高羊茅根頸中HD-ZipI基因的表達(dá)進(jìn)行分析。首先設(shè)計(jì)定量PCR引物(表4)，產(chǎn)物長(zhǎng)度108～197 bp。PCR擴(kuò)增目的條帶，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，F(xiàn)aHOX20及FaHOX21均未擴(kuò)出預(yù)期條帶。對(duì)其余11個(gè)基因進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，結(jié)果表明，F(xiàn)aHOX4和FaHOX6的mRNA表達(dá)水平在短期24 h內(nèi)均不受干旱脅迫影響。FaHOX5,FaHOX8,FaHOX14在處理24 h略微上調(diào)表達(dá)， 而FaHOX25在干旱處理24 h時(shí)下調(diào)表達(dá)。FaHOX12,FaHOX13,FaHOX16,FaHOX22,FaHOX24對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)比較快，處理3 h其表達(dá)水平均發(fā)生顯著的上調(diào)或者下調(diào)。其中，F(xiàn)aHOX22的表達(dá)水平受到干旱脅迫的影響最大，干旱處理6 h時(shí)，其表達(dá)水平上升了約14倍(圖3)。此外，從圖3可以看到，幾乎所有FaHOX基因在24 h內(nèi)其本身的表達(dá)也發(fā)生變化，這說明其表達(dá)量可能受到晝夜節(jié)律的影響。

表3 高羊茅HD-Zip I家族蛋白主要MEME結(jié)構(gòu)域Table 3 Major MEME motif sequences in tall fescue HD-Zip I protein

圖1 高羊茅、水稻及擬南芥HD-Zip I全長(zhǎng)氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.1 Phylogenetic tree analysis of full length amino acids of HD-Zip I in tall fescue, rice and arabidopsis

圖2 高羊茅與水稻中HD-Zip I蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.2 Distribution of conserved motifs for the tall fescue and rice HD-Zip I proteins

基因名稱Genename正向引物Forwardprimer(5′-3′)反向引物Reverseprimer(5′-3′)產(chǎn)物長(zhǎng)度Productlength(bp)FaHOX4AAGCTGGAGGAGGACGAGAGTGTCTCTACCAGGCCTCAT130FaHOX5CGAAGGGTGCAGTTTCCACAGGACGCAGAAAGGATGGAG184FaHOX6CAGAGTACCACCACCACCAGAAGCTTTGCAGATTGTGGCA195FaHOX8TCTTTGTACCACGGATCGCAGGATGCATGGTGGACAACAA193FaHOX12GCTACTTGATGGACTTGGCGCCCATGACACTACCACCAGT185FaHOX13AGCACGTCTCCAACCTCAATACTGTAGTACGCCCTGTCG126FaHOX14CGATGACCTGATGATGTGCGTTGAACACGCACACCTTCAG195FaHOX16GGTGGATGTGGAACTAGGCTGCGATCGATCCCAACATGAC137FaHOX20GTGTTCTTCCACGGGCATCTGCTACCTCAGTTCAGTGCA169FaHOX21CCTCCTCCGTCCCAAAGATGCAAGCCGCGACCATACATG197FaHOX22CTATCGAGTGGAATGCGGTGCGCCTCCTATCTTACACGGA161FaHOX24GTGGTAGCGTGAATCAGCGCGATGTGATCTCCGGAGTCA108FaHOX25GTGGTTCTGGAGCTGATCGACCAGTCAGAGTCGGGTAGTC111

圖3 短期干旱脅迫下FaHD-Zip I的qPCR分析Fig.3 PCR analysis of relative expression level of FaHD-Zip I under 24 h PEG6000 treatment 所有基因的相對(duì)表達(dá)量都以0 h對(duì)照植株根頸中基因表達(dá)量為1。柱子上部*表示相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)PEG6000處理與對(duì)照植株中基因表達(dá)量差異顯著(P<0.05)，下同。Gene expression level of control plants at 0 h was designated as 1. Stars (*) on the top of the bars indicated significant difference between the control and PEG6000-treated plants at a certain time point (P<0.05). The same below.

2.4 長(zhǎng)期干旱脅迫下FaHD-Zip I基因的表達(dá)

進(jìn)一步通過qPCR技術(shù)檢測(cè)長(zhǎng)期干旱脅迫下FaHD-ZipI的表達(dá)水平。結(jié)果表明，干旱處理7 d時(shí)，F(xiàn)aHOX4和FaHOX5的表達(dá)水平均顯著低于對(duì)照，F(xiàn)aHOX8,FaHOX12,FaHOX13,FaHOX22及FaHOX25均顯著上調(diào)，其他幾個(gè)基因(FaHOX6,FaHOX14,FaHOX16及FaHOX24)的表達(dá)水平則不受影響。干旱處理14 d時(shí)，F(xiàn)aHOX6,FaHOX8,FaHOX14,FaHOX16,FaHOX22,FaHOX24及FaHOX25的表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照植株，而FaHOX4,FaHOX5,FaHOX12及FaHOX13的表達(dá)水平則與對(duì)照無顯著差異(圖4)。其中，干旱處理14 d時(shí)，F(xiàn)aHOX22的表達(dá)水平比對(duì)照上調(diào)76.3倍，比其他基因的響應(yīng)更為明顯。

3 討論

3.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)可成為非模式植物進(jìn)行分子生物學(xué)研究的有力工具

長(zhǎng)期以來，參考基因組序列的缺乏極大地限制了非模式植物中進(jìn)行分子生物學(xué)研究的步伐。高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，極大地豐富了非模式植物的轉(zhuǎn)錄譜信息。這不僅能夠從組學(xué)水平上對(duì)特定發(fā)育時(shí)期特定器官和組織中轉(zhuǎn)錄發(fā)生變化的基因水平進(jìn)行一個(gè)評(píng)估，同時(shí)也為分子生物學(xué)研究提供了大量的序列信息。目前已有多個(gè)基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)非模式植物某一類基因進(jìn)行克隆與分析的研究[32-35]。本研究通過搜集他人已發(fā)表的高羊茅轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)[29-31]，整合自己的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)信息，結(jié)合序列搜索、比對(duì)分析、拼接組裝及后期PCR克隆等步驟，較為快速地獲得13個(gè)高羊茅HD-Zip I轉(zhuǎn)錄因子全長(zhǎng)序列。這說明在物種轉(zhuǎn)錄組信息豐富的情況下，采取這種方式能夠?yàn)榉悄Ｊ街参镏谢虻目寺√峁┖芎玫钠脚_(tái)，為后續(xù)進(jìn)行這些基因的功能研究打下了基礎(chǔ)。

3.2 高羊茅中HD-Zip I轉(zhuǎn)錄因子的分析

目前已在不同物種中克隆了多個(gè)HD-Zip I因子并且對(duì)其功能進(jìn)行了研究。本研究中，共獲得13個(gè)高羊茅HD-Zip I因子，比水稻中少1個(gè)。這一方面可能是由于其物種特異性，另外一方面也可能是由于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)還沒有足夠豐富造成的。其他物種，如番茄(Solanumlycopersicum)中有22個(gè)HD-Zip I蛋白[9]，柑橘(Citrussinensis)中16個(gè)[39]，桃(Prunuspersica)中14個(gè)[40]，大豆(Glycinemax)中30個(gè)[10]。由于高羊茅為異源六倍體，會(huì)存在同一個(gè)基因多個(gè)拷貝的情況，因此其實(shí)際的HD-Zip I蛋白數(shù)目必然遠(yuǎn)超過13個(gè)。這13個(gè)HD-Zip I蛋白均包括保守的同源異形盒及亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域，且生物信息學(xué)預(yù)測(cè)均定位于細(xì)胞核，這與其轉(zhuǎn)錄因子的特性也是吻合的。系統(tǒng)進(jìn)化樹表明13個(gè)高羊茅HD-Zip I蛋白，14個(gè)水稻HD-Zip I蛋白及17個(gè)擬南芥HD-Zip I蛋白可以分為8個(gè)進(jìn)化枝，高羊茅與水稻中對(duì)應(yīng)的HD-Zip I蛋白序列更為接近，且與水稻的相應(yīng)蛋白共同分布在5個(gè)進(jìn)化枝，與擬南芥的有較大差異，這說明HD-Zip I蛋白在單雙子葉植物中有明顯的差異。

HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子家族分為I～I(xiàn)V亞類，其中，I類的結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單[5]。本研究通過MEME軟件分析13個(gè)高羊茅HD-Zip I蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，共發(fā)現(xiàn)5個(gè)結(jié)構(gòu)域。高羊茅和水稻中對(duì)應(yīng)蛋白在結(jié)構(gòu)域數(shù)目及排布順序方面幾乎一致，且與系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果也比較吻合，也劃分為5個(gè)亞類。這些結(jié)果說明高羊茅HD-Zip I蛋白的功能可能也與水稻的同源蛋白比較一致。同時(shí)，F(xiàn)aHOX5比OsHOX5多一個(gè)結(jié)構(gòu)域，說明兩個(gè)物種的HD-Zip I蛋白也有不同。這些信息為后期研究高羊茅中蛋白功能提供了借鑒意義。

總的來說，位于同一個(gè)進(jìn)化枝內(nèi)的同源蛋白，其功能也類似。例如擬南芥HB7和HB12對(duì)脫落酸信號(hào)作出響應(yīng)，調(diào)控干旱脅迫條件下的植物生長(zhǎng)[41]，同樣，其在水稻中同源蛋白OsHOX22和OsHOX24通過調(diào)控ABA合成來調(diào)節(jié)水稻的耐旱性[18-19,42]。然而，也有同一亞類內(nèi)蛋白功能不同的報(bào)道。如δ亞族內(nèi)單雙子葉蛋白的功能明顯不同，且同樣單子葉植物中的同源蛋白都可能不一致。例如，目前報(bào)道OsHOX12抑制赤霉素合成，調(diào)控水稻節(jié)間的伸長(zhǎng)[15]，而玉米中OsHOX12同源基因GT1則抑制分蘗芽的伸長(zhǎng)[20]。擬南芥中與OsHOX12同源的HB21，HB40及HB53這3個(gè)蛋白同時(shí)缺失抑制了遮陰脅迫下腋芽的伸長(zhǎng)[22]。由此，在進(jìn)化過程中，HD-Zip I蛋白的功能發(fā)生了很大歧化。另外，就目前的研究來說，其他進(jìn)化枝的蛋白的分子功能如何，也值得以后的工作進(jìn)一步來鑒定。

3.3 干旱脅迫下高羊茅HD-Zip I基因的表達(dá)

研究表明，HD-Zip I蛋白參與植物對(duì)生物及非生物脅迫的應(yīng)答，HD-Zip I可能為激素介導(dǎo)植物響應(yīng)逆境與自身發(fā)育的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。多個(gè)研究表明HD-ZipI基因的表達(dá)水平受到逆境脅迫的顯著影響[6-8,14,18,41-42]?？紤]到某些基因的表達(dá)本身還有晝夜節(jié)律性，本研究中每個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)均做了相應(yīng)的對(duì)照。結(jié)果表明，在24 h內(nèi)，大部分基因的表達(dá)都表現(xiàn)出節(jié)律性。在短期PEG6000模擬干旱處理下，大部分基因的表達(dá)或多或少在某個(gè)時(shí)間點(diǎn)發(fā)生上調(diào)或者下調(diào)表達(dá)，然而除FaHOX22以外，其余基因的表達(dá)變化倍數(shù)均不大。這與其他文獻(xiàn)中報(bào)道的結(jié)果有差異，是由本研究設(shè)定的對(duì)照導(dǎo)致，且本研究的結(jié)果更為準(zhǔn)確和有參考意義。在干旱處理7及14 d時(shí)，有多個(gè)基因表達(dá)水平比對(duì)照發(fā)生了較大程度的上調(diào)(如FaHOX6，F(xiàn)aHOX8，F(xiàn)aHOX14，F(xiàn)aHOX16，F(xiàn)aHOX22，F(xiàn)aHOX24及FaHOX25)。目前僅有FaHOX22和FaHOX24在擬南芥及水稻中的同源基因有較深入的研究，其余均未見報(bào)道。由此，該結(jié)果為高羊茅中這些因子的功能研究提供了參考。此外，本研究沒有涉及高溫、高鹽等其他逆境脅迫和植物激素處理下FaHD-ZipI的表達(dá)分析，這些也需要在今后的工作完成。

4 結(jié)論

基于高羊茅本地轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，通過生物信息學(xué)分析及分子克隆技術(shù)，獲得13個(gè)FaHD-ZipI全長(zhǎng)開放閱讀框，預(yù)測(cè)均定位于細(xì)胞核。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明其分布在5個(gè)進(jìn)化枝，與水稻的HD-ZipI基因有很高的相似性。MEME結(jié)構(gòu)域分析揭示高羊茅與水稻FaHD-Zip I在保守結(jié)構(gòu)域的數(shù)目及排布方式基本一致，且與系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果吻合。qRT-PCR分析FaHD-ZipI基因在短期及長(zhǎng)期PEG6000模擬的干旱脅迫下高羊茅根頸中的表達(dá)水平，結(jié)果表明11個(gè)FaHD-ZipI均能響應(yīng)干旱脅迫，但是響應(yīng)快慢和響應(yīng)的程度有很大區(qū)別。本研究結(jié)果為后續(xù)進(jìn)行高羊茅HD-ZipI基因的功能研究奠定了工作基礎(chǔ)。

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