劉蒙蒙，孫小杰，周正平，袁 丹，劉俊江

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)教研室，貴州 遵義 563099；2.濱州市人民醫(yī)院 病理科，山東 濱州 256610；3.遵義醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院電鏡室，貴州 遵義 563099)

子宮內(nèi)膜癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，在西方發(fā)達(dá)國家高居女性惡性腫瘤之首[1]。目前在發(fā)展中國家，由于人群平均壽命的延長以及激素替代療法的廣泛應(yīng)用，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率也呈上升趨勢[2]。子宮內(nèi)膜癌按流行病學(xué)特征、臨床特點(diǎn)等分為 I型(雌激素依賴型)、II型(非雌激素依賴型)，I型主要病理學(xué)類型為子宮內(nèi)膜樣癌(endometrioid carcinoma,EC)，屬于雌激素依賴性腫瘤，其發(fā)病因素與長期缺乏孕激素對抗的高水平雌激素刺激密切相關(guān)。孕激素可通過與孕激素受體(progesterone receptor,PR)結(jié)合后，下調(diào)雌激素受體(estrogen receptor,ER)的表達(dá)，對抗ER介導(dǎo)的雌激素促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，使增生的子宮內(nèi)膜向分泌期轉(zhuǎn)化，從而避免子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生與發(fā)展[3-6]。

在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，細(xì)胞在正常細(xì)胞周期的調(diào)控下有序增殖，一旦細(xì)胞周期調(diào)控紊亂，則引起細(xì)胞無序增殖，甚至導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。通過各種正負(fù)調(diào)控因子的協(xié)同調(diào)節(jié)，細(xì)胞周期得以正常進(jìn)行。其中，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(cyclin-dependent kinase inhibitors，CKI)是細(xì)胞周期進(jìn)程的負(fù)調(diào)控因子，包括兩大家族，其中Cip/Kip家族包括p57kip2、p21kip1、p27kip1[7]。p57kip2被最晚發(fā)現(xiàn)，在許多腫瘤中表達(dá)降低[8-10]，但目前在子宮內(nèi)膜癌中的研究較少。本研究擬通過對體外培養(yǎng)的JEC細(xì)胞(中分化EC細(xì)胞)進(jìn)行孕激素干擾后，用MTT法觀察JEC細(xì)胞的生長曲線，在光鏡、電鏡下觀察JEC細(xì)胞的生長情況及超微結(jié)構(gòu)變化，用免疫蛋白印跡(Western Blot,WB)法檢測JEC細(xì)胞中ER亞型、PR亞型及p57kip2蛋白的表達(dá)，以探討孕激素對細(xì)胞周期進(jìn)程的干擾調(diào)控，以及對EC發(fā)展的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 人EC中分化JEC細(xì)胞株(遵義醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室)。

1.2 主要試劑 孕酮購于北京華邁科公司，MTT粉劑購于北京Solarbio公司，WB相關(guān)試劑購于上海碧云天生物研究所，鼠抗人β-actin單克隆抗體購于上海碧云天生物研究所，ER兩種亞型、PR兩種亞型、p57kip2鼠抗人單克隆抗體購于美國SantaCruz公司，熒光山羊抗鼠抗體購于美國LI-COR公司。

1.3 主要儀器 倒置顯微鏡(CKX41SF)購于日本OLYMPUS公司，透射電子顯微鏡(H-7650)購于日本日立公司，超薄切片機(jī)(EM UC6)購于德國Leica公司，酶標(biāo)儀購于美國Thermo Fisher公司。

1.4 方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)分組 每90 mL RPMI-1640培養(yǎng)基中加入10 mL胎牛血清、1 mL雙抗(青霉素、鏈霉素混合液)，制成完全培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)組：將P以3種不同濃度(10-4mol/L,10-6mol/L,10-8mol/L)加入完全培養(yǎng)基，對JEC細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)(37 ℃、5%CO2、飽和濕度)。對照組：用不含藥物的等量培養(yǎng)基對JEC細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。

1.4.2 MTT法觀察各組細(xì)胞的增殖情況 將培養(yǎng)的JEC細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液后接種于96孔板，設(shè)空白組、對照組、實(shí)驗(yàn)組，其中空白組只加不含細(xì)胞的等量完全培養(yǎng)基。24 h后PBS沖洗各孔，對照組加入100 μL完全培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組分別加入100 μL高、中、低不同濃度的P溶液，繼續(xù)培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)24、48、72、96 h后，PBS沖洗各孔，每孔加20 μL MTT溶液，再培養(yǎng)4 h后，每孔加100 μL二甲基亞砜，震蕩10 min后用酶標(biāo)儀測各孔的OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.3 倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞的形態(tài)及生長情況 將培養(yǎng)的JEC細(xì)胞制成1×106個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液后接種于6孔板，設(shè)對照組、實(shí)驗(yàn)組，將6孔板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，PBS沖洗各孔，實(shí)驗(yàn)各組分別加入等量不同濃度的P溶液分別培養(yǎng)，于培養(yǎng)24、48、72 h后在倒置顯微鏡下觀察JEC細(xì)胞的生長情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.4 透射電鏡觀察各組細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化 各組JEC細(xì)胞分別培養(yǎng)，通過酶消化、離心成細(xì)胞團(tuán)，加入固定液固定，經(jīng)脫水、浸透、包埋聚合，用超薄切片機(jī)進(jìn)行超薄切片、電子染色，然后在透射電鏡下進(jìn)行觀察。

1.4.5 WB法檢測各組細(xì)胞中ER亞型、PR亞型及p57kip2蛋白的表達(dá) JEC細(xì)胞按照實(shí)驗(yàn)分組分別進(jìn)行培養(yǎng)，于培養(yǎng)24、48、72 h后，分別提取各組細(xì)胞總蛋白，檢測所提蛋白濃度。按照配膠說明書配制分離膠，待分離膠完全凝好后，配制濃縮膠并插入梳子。拔出梳子，加入電泳液，在第一個(gè)孔加入彩色預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，其余各孔分別加入相應(yīng)蛋白樣品。80V電壓下電泳約15 min，120 V電壓下電泳約50 min。切下目的蛋白所在區(qū)域的凝膠后，220 mA電流下轉(zhuǎn)膜約110 min。室溫封閉約2 h后，將膜取出放入配好的相應(yīng)一抗稀釋液中(p57kip2、ERα、ERβ、PR-A、PR-B單克隆抗體稀釋比例均為1∶200，β-actin單克隆抗體稀釋比例為1∶1 000)，4 ℃搖床上過夜。用TBS溶液洗膜2次，TBST溶液洗膜1次，每次約10 min。把膜放入二抗稀釋液(稀釋比例為1∶10 000)中，室溫下避光約2 h。再次洗膜，掃描成像后測各組條帶OD值。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞的增殖情況 相同實(shí)驗(yàn)分組比較：隨著藥物作用時(shí)間的延長，對照組與P各濃度組JEC細(xì)胞均逐漸增殖，各時(shí)間段之間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

相同作用時(shí)間比較：與對照組JEC細(xì)胞比較，P低、中濃度組細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)，高濃度組的增殖能力減弱，其中低、高濃度組分別與對照組之間比較，高濃度組分別與低、中濃度組之間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表1，圖1)。

組別24h48h72h96h對照12.69±0.4318.83±0.6227.92±0.2031.44±0.84P低濃度▲※13.37±0.0921.03±1.1030.05±1.1733.05±0.44P中濃度※13.23±0.4220.06±1.0629.08±1.6032.10±0.73P高濃度▲11.60±0.2416.78±1.2924.76±0.8429.11±0.27

▲與對照組比較，※與高濃度組比較，P<0.05。

圖1 MTT法檢測P干擾JEC細(xì)胞的生長曲線

2.2 各組細(xì)胞的形態(tài)及生長情況 培養(yǎng)72 h后，對照組JEC細(xì)胞呈多邊形、長梭形、不規(guī)則形，局部細(xì)胞圍成腺腔樣結(jié)構(gòu)；隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，細(xì)胞密度逐漸增大，且伴少量細(xì)胞凋亡。與對照組比較，P干擾后低、中濃度組細(xì)胞密度略有增大，高濃度組則明顯減??；各組細(xì)胞的形態(tài)未見明顯改變(見圖2)。

2.3 各組細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化 培養(yǎng)72 h后，對照組JEC細(xì)胞形態(tài)以圓形或橢圓形為主，表面可見微絨毛，細(xì)胞內(nèi)可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細(xì)胞器，還可見分泌泡、次級溶酶體等結(jié)構(gòu)，核呈不規(guī)則形，核仁明顯。與對照組比較，P各濃度組胞質(zhì)內(nèi)均可見自噬現(xiàn)象，中濃度組細(xì)胞表面微絨毛出現(xiàn)體積增大、融合等形態(tài)改變，高濃度組細(xì)胞表面微絨毛及胞質(zhì)內(nèi)分泌泡均增多(見圖3～6)。

A:對照組;B:P低濃度組;C:P中濃度組;D:P高濃度組。圖2 P干擾 JEC細(xì)胞72 h后的生長情況(×100)

Bar=5.0 μm。圖3 JEC細(xì)胞對照組72 h時(shí)的超微結(jié)構(gòu)變化

可見自噬現(xiàn)象(↑)，A,B:Bar=5.0 μm,2.0 μm。圖4 JEC細(xì)胞P低濃度組72 h時(shí)的超微結(jié)構(gòu)變化

可見微絨毛腫脹、融合(↑↑)，分泌泡增多(▲)，Bar=5.0 μm。圖5 JEC細(xì)胞P中濃度組72 h時(shí)的超微結(jié)構(gòu)變化

分泌泡增多(▲)，A,B:Bar=5.0μm,2.0μm。圖6 JEC細(xì)胞P高濃度組72 h時(shí)的超微結(jié)構(gòu)變化

2.4 各組細(xì)胞中ER亞型、PR亞型及p57kip2蛋白的表達(dá)情況

2.4.1 P干擾后，對照組及各濃度組JEC細(xì)胞均無ERα、PR-A、PR-B蛋白的表達(dá)(見表2，圖7)。

2.4.2 隨著P干擾濃度的增高，在24、72 h時(shí)，ERβ蛋白表達(dá)逐漸增加，在48 h時(shí)，ERβ蛋白在高濃度組表達(dá)最高，在中濃度組表達(dá)最低，但僅72 h各實(shí)驗(yàn)組與對照組之間表達(dá)差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨著P干擾時(shí)間的延長， ERβ蛋白在高濃度組表達(dá)逐漸增高，在低、中濃度組以72 h表達(dá)最高、 48 h表達(dá)最低，但僅高濃度組在24 h與72 h之間表達(dá)差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，中濃度組在24 h與72 h、48 h與72 h之間表達(dá)差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表2，圖7)。

2.4.3 隨著P干擾濃度的增高，p57kip2蛋白表達(dá)增高，但僅在48 h，中、高濃度組分別與對照組之間，高濃度組與低濃度組之間表達(dá)差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在72 h，高濃度組與對照組之間表達(dá)差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨著P干擾時(shí)間的延長，p57kip2蛋白在各組表達(dá)均逐漸增高，但僅高濃度組在24 h與48 h、24 h與72 h之間表達(dá)差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表2，圖7)。

時(shí)間組別ERβp57kip2ERαPR-APR-B24h對照 3.90±0.6515.73±0.64---低濃度3.94±0.4115.40±0.24---中濃度3.94±0.6115.64±0.87---高濃度4.12±0.45★15.70±0.88△---48h對照 3.87±1.4615.45±0.78---低濃度3.86±0.3515.99±0.28---中濃度3.80±1.5416.53±0.56▽---高濃度5.54±0.9517.03±0.38◆---72h對照 3.17±0.3515.40±1.16---低濃度4.85±0.42▲16.23±0.98---中濃度5.00±0.56▲※16.65±0.61---高濃度5.82±0.99▲17.23±0.54#---

★與72 h高濃度組比較；※與24、48 h中濃度組比較；▲與72 h對照組比較；△與48、72 h高濃度組比較；◆與48 h對照組、低濃度組比較；▽與48 h對照組比較；#與72 h對照組比較，P<0.05。

(孕酮干預(yù)24 h) (孕酮干預(yù)48 h) (孕酮干預(yù)72 h)A:對照組；B:P低濃度組；C:P中濃度組；D:P高濃度組。圖7 WB檢測P干預(yù)JEC細(xì)胞后ERα、ERβ、PR-A、PR-B、 p57kip2蛋白的表達(dá)

2.5 P干擾后JEC細(xì)胞中ERβ、p57kip2蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果，P=0.094>0.05， ERβ蛋白與p57kip2蛋白表達(dá)之間尚不能認(rèn)為有相關(guān)關(guān)系。

3 討論

基于孕激素對子宮內(nèi)膜的調(diào)控作用，孕激素的激素療法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于治療子宮內(nèi)膜增生和高分化子宮內(nèi)膜癌。尤其對于有生育要求的早期子宮內(nèi)膜癌患者，孕激素治療成為子宮內(nèi)膜癌的主要內(nèi)分泌治療方法[11]。Wang等[12]研究發(fā)現(xiàn)，對于早期子宮內(nèi)膜癌患者，行宮腔鏡電切術(shù)聯(lián)合口服醋酸甲地孕酮治療，在患者完全緩解后可自然受孕并生育健康嬰兒。Mitsuhashi等[13]研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌患者經(jīng)醋酸甲羥孕酮聯(lián)合二甲雙胍治療后，其復(fù)發(fā)率降低。本研究結(jié)果顯示，P在低、中濃度時(shí)，對JEC細(xì)胞增殖有一定促進(jìn)作用，部分細(xì)胞表面微絨毛出現(xiàn)不同程度腫脹、融合等形態(tài)改變；高濃度時(shí)，則對JEC細(xì)胞的增殖有抑制作用，細(xì)胞表面微絨毛稍有增多，部分細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)分泌泡明顯增多。提示P對JEC細(xì)胞具有雙重調(diào)控作用，其濃度較低時(shí)有一定促進(jìn)細(xì)胞生長的作用，使細(xì)胞分化向較差的方向發(fā)展；其濃度較高時(shí)則可抑制細(xì)胞的生長，使細(xì)胞分化向較好的方向發(fā)展。

ER、PR是女性內(nèi)分泌調(diào)控過程中最重要的兩種激素受體，在人體許多組織中有表達(dá)。孕激素與PR結(jié)合后，可抑制ER的合成，破壞ER的穩(wěn)定性，加快ER及雌激素在人體內(nèi)的降解，使體內(nèi)ER及雌激素水平下降，ER功能減弱，以對抗雌激素促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用[14]。在哺乳動(dòng)物中，ER 主要有ERα、ERβ兩種亞型，二者結(jié)構(gòu)相似，功能上存在差異。目前研究認(rèn)為，ERα可與雌二醇結(jié)合后促進(jìn)細(xì)胞增殖，ERβ則可抑制細(xì)胞的增殖，且能抑制ERα的功能，但也有研究發(fā)現(xiàn)，在沒有ERα表達(dá)的情況下，ERβ可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移[15]。且有研究發(fā)現(xiàn)，ERα表達(dá)下降和ERβ的表達(dá)上調(diào)可能提示食管鱗狀細(xì)胞癌患者的不良預(yù)后[16]。因此，關(guān)于ERα和ERβ在腫瘤中的作用目前還存在一定爭議。此外，許多研究表明，ERα和ERβ在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)也有異常[17-18]。PR主要有PR-A、PR-B兩種亞型，二者在同一正常組織中往往均有表達(dá)，但從正常組織到惡性變的過程中，會出現(xiàn)PR-A、PR-B的表達(dá)失衡。Yu等[19]通過免疫組化法(S-P法)檢測不同子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PR在子宮內(nèi)膜癌組織中表達(dá)最低，在不典型增生組織中表達(dá)較高，在正常子宮內(nèi)膜組織中表達(dá)最高。因此推測，PR表達(dá)降低與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。Kavlashvili等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中，孕激素可上調(diào)PR基因與蛋白的表達(dá)。本課題組前期通過對人子宮內(nèi)膜不同病變組織的研究發(fā)現(xiàn)，ER、PR蛋白在EC組織中表達(dá)最低，在子宮內(nèi)膜增生性病變組織中表達(dá)最高[21]，推測與孕激素的調(diào)控有關(guān)，也可能與ER、PR亞型在子宮內(nèi)膜癌中的不同表達(dá)有關(guān)。本研究顯示，隨著P作用濃度的增高、作用時(shí)間的延長，各組細(xì)胞ERβ蛋白表達(dá)均有增高趨勢；對照組及P各濃度組JEC細(xì)胞均無ERα、PR-A、PR-B蛋白表達(dá)。提示P可能通過上調(diào)JEC細(xì)胞中ERβ蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞的生長；JEC細(xì)胞為 ERα、PR-A、PR-B蛋白表達(dá)均缺失的細(xì)胞株，且P不能誘導(dǎo)其表達(dá)。

p57kip2作為CKI中Cip/Kip家族中的一員，可以更廣泛的抑制cyclin-CDK復(fù)合物的活性，阻滯細(xì)胞從G1期向S期過渡，負(fù)向調(diào)控細(xì)胞周期，以達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞惡性增殖的效果[22]。目前研究發(fā)現(xiàn)，p57kip2在乳腺癌、肝癌、肺癌等許多腫瘤中表達(dá)降低，且與腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移等有關(guān)，被認(rèn)為是一種重要的腫瘤抑制基因[8-10]。研究發(fā)現(xiàn)，孕激素可通過調(diào)節(jié)多種細(xì)胞周期蛋白，使細(xì)胞周期停滯在G1/S期，并可上調(diào)CKI、p21kip1、p27kip1以及抑癌基因p53的表達(dá)，從而發(fā)揮抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖的作用[23]。Kim等[24]研究發(fā)現(xiàn)，p57kip2蛋白在分泌期子宮內(nèi)膜細(xì)胞中表達(dá)較高，在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中表達(dá)較低；且孕激素可上調(diào)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中p57kip2mRNA的表達(dá)水平。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，p57kip2在EC組織中的表達(dá)低于在分泌期子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)[21]，推測p57kip2在EC中的表達(dá)可能受到孕激素的調(diào)控。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著P作用濃度的增高、作用時(shí)間的延長，各組細(xì)胞p57kip2蛋白的表達(dá)均有增高趨勢。提示隨著P作用濃度的增高、作用時(shí)間的延長，可能通過誘導(dǎo)JEC細(xì)胞中p57kip2蛋白的表達(dá)逐漸增加，發(fā)揮負(fù)向調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程的作用，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長。

綜上所述， P可上調(diào)JEC細(xì)胞中ERβ、p57kip2蛋白的表達(dá)。P濃度較低時(shí)，JEC細(xì)胞中ERβ、p57kip2蛋白的表達(dá)均有所增加，但可能以ERβ蛋白促細(xì)胞生長的作用為主，促進(jìn)JEC細(xì)胞增殖，使細(xì)胞向更差的分化方向發(fā)展；濃度較高時(shí)則可能以p57kip2蛋白阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程的作用為主導(dǎo)，抑制JEC細(xì)胞增殖，使細(xì)胞向較好的分化方向發(fā)展。JEC細(xì)胞中ERα、PR-A、PR-B蛋白均無表達(dá)，且P干擾刺激也不能誘導(dǎo)其表達(dá)，因此推測孕激素可能通過ERβ，而不是通過ERα、PR-A、PR-B對JEC細(xì)胞發(fā)揮調(diào)控作用。提示聯(lián)合檢測ERα、ERβ、PR-A、PR-B、p57kip2蛋白在EC中的表達(dá)情況，更有利于評估EC的發(fā)生發(fā)展。

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