Brown-Norway大鼠咳嗽變異性哮喘模型的建立

楚慧倫，孔德明，丁子桐，高琴琴，續(xù) 艷，閻 玥，李友林，孫文燕*

(1.北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 100102； 2.中日友好醫(yī)院國家中醫(yī)藥管理局肺病慢性咳嗽重點研究室，北京 100102)

咳嗽變異性哮喘(cough variant asthma，CVA)是一種特殊類型的哮喘，臨床主要表現(xiàn)為慢性持續(xù)性干咳[1]，通常咳嗽比較劇烈，以夜間咳嗽為其重要特征，但無明顯喘息、氣促等癥狀或體征。感冒、冷空氣、灰塵、油煙等容易誘發(fā)或加重咳嗽[2]。有研究表明，CVA是典型哮喘的前驅(qū)，約有30%的患者隨著接觸變應原時間的增長而發(fā)展為典型哮喘[3-4]，嚴重威脅公眾健康。

CVA的發(fā)病機制與典型哮喘的發(fā)病機制相似[5]，主要與變應原致敏、氣道慢性炎性反應、氣道高反應性和氣道重塑等密切相關。研究表明氣道慢性炎癥是各型各期哮喘病的共同病理學特征，是氣道可逆性阻塞和非特異性氣道高反應性的重要決定性因素，炎癥的輕重反映哮喘病情的輕重。

Brown-Norway(BN)大鼠是高免疫球蛋白(尤其是IgE)應答品系[6]，更易誘發(fā)出CVA癥狀以及氣道變應性炎癥與氣道高反應性，而目前我國常用的SD大鼠、Wistar大鼠等穩(wěn)定性欠佳。故本研究擬用卵蛋白(ovalbumin，OVA)腹腔注射加霧化激發(fā)的方法，建立一種簡便易行的咳嗽變異性哮喘BN大鼠模型，并使用臨床常用的咳嗽變異性哮喘治療藥物孟魯斯特鈉作為陽性藥，以評價模型的適用性。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

Brown-Norway(BN)大鼠36只，SPF級，雌雄各半，體重180～200 g，8周齡左右，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供 [SCXK (京) 2016-0011]。動物飼養(yǎng)于中日友好醫(yī)院屏障環(huán)境中[SYXK (京) 2016-0043]，溫度22℃～24℃，濕度44%～50%。

1.2 主要試劑與儀器

順爾寧片(孟魯斯特鈉)，杭州默沙東制藥有限公司，產(chǎn)品批號：N007972；卵清白蛋白(卵蛋白，OVA)：美國Sigma公司，批號：09/2017；辣椒素：美國Sigma公司，批號：MKBN8613V；溴化乙酰膽堿，東京化成工業(yè)株式會社，批號：JQTEN-BD；戊巴比妥鈉，德國Merck公司，生產(chǎn)批號：08/2017。

A02AI超聲波霧化器：上海魚躍醫(yī)療設備有限公司；AniRes2005動物肺功能分析系統(tǒng)：北京貝蘭博科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型的制備及分組給藥

大鼠隨機分成三組(正常對照組、模型對照組、給藥組)。第1日腹腔注射2 mg卵蛋白(OVA)和100 mg Al(OH)3，3周后再次腹腔注射0.01 mg OVA及100 mg Al(OH)3，正常對照組注射等量生理鹽水。3周后模型對照組和給藥組開始用1% OVA進行霧化攻擊，正常對照組用生理鹽水，隔日一次，共7次。霧化當天開始給藥，在霧化前30 min給藥組進行孟魯斯特鈉(1.3 mg/kg)灌胃給藥，模型對照組與正常對照組灌胃等量飲用水，每天一次，共14次。本實驗方案經(jīng)過中日友好醫(yī)院實驗動物福利倫理委員會審查，符合動物保護、動物福利和倫理原則，符合國家實驗動物福利倫理相關規(guī)定，編號：170101。本實驗實施過程中嚴格遵守動物使用的3R原則。

1.3.2 辣椒素引咳實驗

最后一次給藥24 h后，各組大鼠置于霧化箱內(nèi)，霧化吸入10-4mol/L辣椒素溶液60 s，記錄2 min內(nèi)各組大鼠的咳嗽次數(shù)。

1.3.3 肺功能測定(激發(fā)實驗)

將各組大鼠以2%戊巴比妥鈉80 mg/kg腹腔注射麻醉，行氣管有創(chuàng)插管，仰臥于小動物呼吸機的密閉體描箱內(nèi)，氣管插管與體描箱相連，觀察氣道壓力波形正常后，建立頸總靜脈給藥通路，保證通路順暢后關閉體描箱，待氣道壓力曲線平穩(wěn)后，每隔5 min依次輸入以下四個劑量的乙酰甲膽堿：0.025 mg/kg、0.05 mg/kg、0.1 mg/kg、0.2 mg/kg。檢測用藥后大鼠吸氣總氣道阻力(RL)和動態(tài)順應性(Cdyn)。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 辣椒素引咳實驗

與正常對照組比較，模型對照組咳嗽次數(shù)顯著增多(P< 0.01)；與模型對照組比較，給藥組的咳嗽次數(shù)顯著減少(P< 0.05)，說明模型對照組對辣椒素的刺激更加敏感(見表1)。

2.2 肺功能(激發(fā)實驗)測定

2.2.1 吸氣總氣道阻力(RL)

第一次激發(fā)，各組之間差異無顯著性(P> 0.05)。第二次激發(fā)，與正常對照組比較，模型對照組RL顯著上升(P< 0.05)；與模型對照組比較，給藥組RL顯著下降(P< 0.01)。第三次激發(fā)，與正常對照組比較，模型對照組RL顯著上升(P< 0.05)；與模型對照組比較，給藥組RL顯著下降(P< 0.05)。第四次激發(fā)中，與正常對照組比較，模型對照組RL顯著上升(P< 0.05)(見表2)。說明模型對照組吸氣氣道阻力明顯高于正常對照組。

2.2.2 動態(tài)順應性(Cdyn)

與正常對照組比較，模型對照組Cdyn在第二、三次激發(fā)中顯著下降(P< 0.05)，在第四次激發(fā)中也顯著下降(P< 0.01)。與模型對照組比較，給藥組Cdyn在第二次(P< 0.01)、第三次(P< 0.05)、第四次(P< 0.01)激發(fā)中均顯著上升，說明模型對照組肺動態(tài)順應性明顯低于正常對照組，而孟魯斯特鈉可以有效緩解這一癥狀(見表3)。

Tab.1Comparison of times of coughing

組別Groups大鼠數(shù)量Numberofrats咳嗽次數(shù)Timesofcoughing正常對照組Normalcontrolgroup12367±223模型對照組Modelgroup111233±656??孟魯斯特鈉組Montelukastgroup12492±231△

注：與正常對照組比較，**P< 0.01；與模型對照組比較，△P< 0.05。

Note. Compared with the normal control group,**P< 0.01. Compared with the model group,△P< 0.05.

Tab.2Comparison of RLin the test of bronchial responsiveness

組別Groups大鼠數(shù)量Numberofrats第一次激發(fā)Firstexcitation第二次激發(fā)Secondexcitation第三次激發(fā)Thirdexcitation第四次激發(fā)Fourthexcitation正常對照組Normalcontrolgroup12055±010054±009056±011055±006模型對照組Modelgroup11063±016065±008?069±011?079±025?孟魯斯特鈉組Montelukastgroup12057±010050±005△△056±007△060±009

注：與正常對照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01；與模型對照組比較，△P< 0.05，△△P< 0.01。

Note. Compared with the normal control group,*P< 0.05,**P< 0.01. Compared with the model group,△P< 0.05,△△P< 0.01.

Tab.3Comparison of Cdynin the test of bronchial responsiveness

組別Groups大鼠數(shù)量Numberofrats第一次激發(fā)Firstexcitation第二次激發(fā)Secondexcitation第三次激發(fā)Thirdexcitation第四次激發(fā)Fourthexcitation正常對照組Normalcontrolgroup12012±002012±002012±002012±002模型對照組Modelgroup11011±003009±003?009±004?008±003??孟魯斯特鈉組Montelukastgroup12013±002013±001△△013±002△012±001△△

注：與正常對照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01；與模型對照組比較，△P< 0.05，△△P< 0.01。

Note. Compared with the normal control group,*P< 0.05,**P< 0.01. Compared with the model group,△P< 0.05,△△P< 0.01.

3 討論

咳嗽變異性哮喘(cough variant asthma，CVA)是以慢性咳嗽為惟一或主要臨床表現(xiàn)，不伴有明顯喘息的一種特殊類型的支氣管哮喘，又稱為咳嗽型哮喘、隱匿型哮喘或過敏性咳嗽。患者具有氣道高反應性和氣道炎癥等病理特征，其氣道高反應性的程度與典型哮喘患者相似或略低，但CVA患者的呼吸道狹窄癥狀并沒到引起喘息的程度，故只出現(xiàn)咳嗽而沒有喘息癥狀，并且在支氣管激發(fā)試驗吸入乙酰膽堿的過程中，CVA主要表現(xiàn)為咳嗽，喘息的發(fā)生率明顯較低[7]。有研究顯示，CVA患者與典型哮喘患者相比，在生活中更加焦慮、壓力更大[8]，嚴重危害公眾健康，為了提高CVA疾病的治療效果，CVA動物模型的研發(fā)必不可少。

CVA的發(fā)病機制與哮喘相似，因此兩者的動物模型都主要通過卵蛋白(OVA)致敏造模。而CVA造模多用Al(OH)3作為佐劑，哮喘多采用OVA聯(lián)合百日咳的造模方法[9]。且因CVA的主要臨床表現(xiàn)為咳嗽，所以實驗中往往加入辣椒素引咳的內(nèi)容，其結果也是證明模型成功與否的重要指標。

目前CVA動物模型的復制，國際上多使用Brown-Norway(BN)大鼠，而國內(nèi)常用的SD大鼠、Wistar大鼠等穩(wěn)定性欠佳，在國際上很難被認可。且有研究顯示，BN大鼠在致敏原的激發(fā)下，能產(chǎn)生較高水平的特異性IgE、IgG抗體，具有較強的致敏免疫反應[10]，與CVA臨床癥狀接近。本研究即是在傳統(tǒng)CVA動物模型復制方法的基礎上[11-14]，通過采用BN大鼠，建立一種簡便易行的CVA動物模型。

實驗中辣椒素引咳結果顯示，模型對照組咳嗽次數(shù)明顯高于正常對照組，給藥組咳嗽次數(shù)明顯少于模型對照組，說明模型對照組對辣椒素的刺激更加敏感，符合CVA患者在外界因素刺激下咳嗽加劇的癥狀。

氣道高反應性是CVA重要的生理學改變，也是診斷的重要指標[15]，本實驗采用有創(chuàng)肺功能檢測方法，觀察乙酰甲膽堿激發(fā)實驗中BN大鼠的RL和Cdyn趨勢。結果顯示，第一次激發(fā)中各組之間RL和Cdyn差異均無顯著性，從第二次激發(fā)開始，模型對照組的RL上升程度和Cdyn下降程度都明顯超過正常對照組，給藥組RL上升幅度和Cdyn下降幅度都明顯小于模型對照組。提示模型對照組肺功能明顯低于正常對照組，而孟魯斯特鈉緩解了這一癥狀，與臨床實驗結果[16-17]接近。

本研究結果顯示，模型對照組的咳嗽癥狀和氣道高反應性符合CVA的臨床癥狀，故所建立的BN大鼠咳嗽變異性哮喘模型與CVA患者的基本特征接近，可用于CVA治療藥物的干預性研究，而其生化及免疫反應特征尚有待于進一步研究。

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