李 波，王 沈，顏昭勇，張建省，楊 濤，張洪新*，袁 鵬

(1.第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院 疼痛科， 陜西 西安 710038； 2.中國人民解放軍第463醫(yī)院 特診科， 遼寧 沈陽 110042；3.空軍94259部隊衛(wèi)生隊， 山東 蓬萊 265600)

原發(fā)性肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是中國高發(fā)惡性腫瘤之一，雖然近年來隨著以手術(shù)為主，介入治療等多種方法為輔的綜合治療不斷進步，HCC患者的整體生存時間有所增加，但其病死率仍均居高不下[1]。隨著精準(zhǔn)醫(yī)療的要求，基于肝細胞肝癌分子分型進行分類治療成為當(dāng)前HCC治療的基本要求。大量研究表明惡性腫瘤患者的多個生物節(jié)律基因發(fā)生紊亂是常見的現(xiàn)象，并且這種紊亂與腫瘤的惡性生物行為密切聯(lián)系[2]。Per2作為晝夜生物節(jié)律形成中的重要負性調(diào)控因子[3]，可調(diào)控多種基因的轉(zhuǎn)錄，是抑制腫瘤發(fā)生、進展的關(guān)鍵因素[4- 5]。已有研究證實Per2在卵巢癌[6]、頭頸部癌[7]、慢性白血病[8]、胃癌[9]和前列腺癌[10]中表達下調(diào)，上調(diào)其表達能夠顯著抑制腫瘤細胞增殖。Per2在HCC中表達下調(diào)[11]，但其與HCC患者的臨床病理特征、預(yù)后及在HCC細胞中的生物學(xué)功能均尚不明確。本研究探索了Per2在HCC組織中表達變化，分析其與患者預(yù)后的關(guān)系和對細胞生長的影響，以期為HCC的臨床預(yù)后判斷和分子靶向治療提供實驗依據(jù)和新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床標(biāo)本：收集2000—2016年在唐都醫(yī)院接受原發(fā)性肝細胞肝癌手術(shù)切除術(shù)標(biāo)本117例，所有病例的臨床資料均完整，均經(jīng)病理診斷確診為肝細胞肝癌，所用標(biāo)本詳細信息見表1。該研究通過唐都醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)并取得所有涉及此項研究患者的同意。

1.1.2 細胞及主要試劑：肝癌細胞SMMC- 7721(中國科學(xué)院上海細胞庫)；胎牛血清(杭州四季青公司)；RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco公司)；LipofectamineTM2000(Invitrogen公司)；Per2真核表達質(zhì)粒及對照組質(zhì)粒(Gencopoeia公司)；兔多克隆抗體Per2(Abcam公司和武漢三鷹公司)；兔多抗β-Tubulin抗體(武漢三鷹公司)；羊抗兔二抗(上海碧云天公司)；凋亡檢測試劑盒(上海貝博生物公司)；MTS試劑(Promega公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染：在含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，在37 ℃，5% CO2的條件下培養(yǎng)SMMC- 7721細胞。細胞按4×105個/孔接種于6孔板中，將Per2真核表達質(zhì)粒和LipofectamineTM2000混合后加入到6孔板細胞內(nèi)，轉(zhuǎn)染后細胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.2 免疫組化檢測：肝癌組織病理石蠟切片依序脫蠟，檸檬酸鹽緩沖液進行高壓抗原修復(fù)，3% H2O2溶液浸泡15 min，山羊血清28 ℃，封閉20 min。將稀釋好的抗Per2多克隆抗體覆蓋切片，4 ℃，過夜孵育。PBS洗滌3次后加二抗工作液，37 ℃恒溫箱孵育20 min。PBS洗滌3次后加辣根過氧化物酶，28 ℃恒溫箱孵育20 min。PBS搖洗3次，加入DAB顯色5～8 min。蘇木精復(fù)染，室溫3 min，1%鹽酸乙醇分化2～3 s。依序脫水、透明和封片。染色結(jié)果判讀：400×視野下隨機選5個不同視野。計算陽性細胞百分比：<5%為0分、5%～25%為1分、26%～50%為2分、51%～75%為3分、76%～100%為4分。細胞著色程度：未染色記為0分、淺黃色為1分、棕黃色為2分、棕褐色為3分。兩個評分結(jié)果相乘得到的分?jǐn)?shù)為最終該分子的染色得分。

1.2.3 Western blot檢測蛋白水平：經(jīng)轉(zhuǎn)染48 h的Per2過表達質(zhì)粒組和對照質(zhì)粒組肝癌SMMC- 7721細胞，胰蛋白酶消化，裂解液裂解細胞，提取細胞蛋白。10%的SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白樣品，經(jīng)轉(zhuǎn)膜后5%脫脂牛奶封閉1 h，加Per2的一抗，4 ℃孵育過夜。TBST漂洗3次，二抗室溫孵育2 h，TBST漂洗3次，ELC顯色。

1.2.4 MTS法檢測細胞增殖：96孔板鋪種SMMC- 7721細胞，每孔加培養(yǎng)基100 μL，每組設(shè)置5個復(fù)孔，同時設(shè)置只加培養(yǎng)基無細胞的空白對照組。96孔板每孔加20 μL的MTS試劑，細胞培養(yǎng)箱孵育2 h后在490 nm波長下檢測細胞的吸光度值。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡：胰蛋白酶消化6孔板SMMC- 7721細胞，預(yù)冷PBS洗滌細胞2次，500 μL結(jié)合液重懸細胞，調(diào)整細胞至1×106個/mL。細胞懸液中加入5 μL的ANXA5-FITC和5 μL的PI染料，充分混勻，4℃避光孵育15 min。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Per2在HCC組織的表達情況

117例HCC組織中，Per2表達陽性率為70.94%，顯著低于對應(yīng)癌旁肝組織的87.18%。癌組織中Per2染色評分為2.14±1.76，顯著低于癌旁肝組織的6.39±3.84(P<0.01)(圖1)。

圖1 Per2在肝癌組織和癌旁組織中的表達Fig 1 Expression level of Per2 in HCC tissues and adjacent tissues(×400)

2.2 HCC患者Per2的表達高低與患者臨床病理特征的相關(guān)性分析

將117例HCC患者按照Per2免疫組化評分結(jié)果分為低表達Per2組和高表達Per2組。Per2表達與HCC患者的腫瘤直徑、門脈侵襲和TNM分期相關(guān)(P<0.05)(表1)。

表1 Per2表達水平與HCC患者臨床特征的相關(guān)性

Abbreviations: HBsAg.hepatitis B surface antigen; AFP.α-fetoprotein; PVTT.portal vein tumor thrombosis; TNM.tumor nodes metastases.

2.3 Per2表達與肝細胞肝癌預(yù)后的關(guān)系

Per2低表達的患者總體生存期(overall survival, OS)和無復(fù)發(fā)生存期(recurrence-free survival, RFS)較Per2高表達的患者短(P<0.05)(圖2)。

2.4 Per2影響肝癌SMMC- 7721細胞增殖

轉(zhuǎn)染Per2真核表達質(zhì)粒組Per2相對蛋白表達為2.76±0.47， 顯著高于轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒組Per2相對蛋白表達1.10±0.30(P<0.01)。在SMMC- 7721細胞中轉(zhuǎn)染Per2真核表達質(zhì)?？蓾M足后續(xù)細胞功能試驗研究的需求(圖3)。

EV.control plasmids; Per2.Per2 eukaryoticexpression plasmid圖3 Western blot檢測各組細胞蛋白表達Fig 3 Expression of proteins in groups were measured by Western blot

與轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒組相比，轉(zhuǎn)染Per2真核表達質(zhì)粒組細胞增殖顯著受到抑制，轉(zhuǎn)染后第3天，Per2過表達組吸光度為0.501±0.063，顯著低于對照組的0.812±0.060(P<0.01)(圖4)。

EV.control plasmids; Per2.Per2 eukaryotic expression plasmid; *P< 0.01 compared with EV groups圖4 Per2對肝癌SMMC- 7721細胞增殖的影響Fig 4 Effect of Per2 on proliferation of SMMC- 7721

2.5 Per2對肝癌SMMC- 7721細胞凋亡分析

過表達Per2組細胞凋亡百分比為22.83±2.27，顯著高于對照組的10.63±1.62(P<0.01)(圖5)。

EV.control plasmids; Per2.Per2 eukaryotic expression plasmid圖5 Per2對肝癌SMMC- 7721細胞凋亡的影響Fig 5 Effect of Per2 on apoptosis of SMMC- 7721 cells

3 討論

近年來，Per2作為新的候選抑癌基因已在多種惡性腫瘤組織中被發(fā)現(xiàn)其表達下調(diào)，且與腫瘤進展和患者預(yù)后相關(guān)。在本研究117例肝癌病例中，癌組織Per2表達陽性率顯著低于癌旁肝組織中表達陽性率，而Per2免疫組化評分癌組織中Per2染色評分僅為癌旁肝組織Per2染色評分的30%。同時本研究在4個肝癌公共數(shù)據(jù)(GSE14520、GSE22058、GSE25097、TCGA)共計622例HCC中發(fā)現(xiàn)，癌組織中Per2的mRNA表達同樣顯著降低(結(jié)果未展示)。該結(jié)果與既往Per2在其他腫瘤中的表達情況相一致，也與在中國臺灣地區(qū)46例HCC患者和貴陽地區(qū)40例HCC患者中Per2在癌組織中表達水平顯著下降的結(jié)果一致[11- 12]。

目前臨床缺乏早期診斷HCC和HCC完全切除術(shù)后判斷預(yù)后的有效生物學(xué)指標(biāo)，造成患者在就診時已處于中晚期，而在手術(shù)后腫瘤易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此，尋找有效反映HCC復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)志物成為精準(zhǔn)醫(yī)療的當(dāng)務(wù)之急。本研究發(fā)現(xiàn)Per2表達與腫瘤直徑、門脈侵襲和TNM分期等因素相關(guān)，Per2低表達的患者總體生存期和無復(fù)發(fā)生存期均較Per2高表達的患者短。上述結(jié)果表明Per2有望作為肝癌獨立預(yù)后判斷指標(biāo)，下一步需擴大病例樣本進行驗證。

目前對于Per2發(fā)揮抑癌作用及機制尚未完全清楚。研究顯示，Per2參與包括細胞增殖、周期、凋亡和轉(zhuǎn)移等多項調(diào)控，如前列腺癌細胞中過表達Per2會抑制細胞增殖和存活[10]?？谇涣谞畎┘毎懈缮鍼er2，細胞周期相關(guān)分子cyclinA2、cyclinB1、cyclinD1、CDK4、CDK6和E2F1增加，而p53、p16和p21減少，G1/G0期細胞減少，細胞凋亡減少[13]。在X線誘導(dǎo)U343膠質(zhì)瘤細胞DNA凋亡模型中，干涉Per2會減少DNA損傷和細胞死亡，Per2通過增加P53活性和表達來抑制腫瘤細胞增殖、DNA損傷修復(fù)及增加凋亡[4]。乳腺癌中Per2缺失會增強EMT及相關(guān)蛋白表達[14]。本研究中過表達Per2會顯著抑制肝癌SMMC- 7721細胞增殖和促進細胞凋亡，這與Per2表達和HCC患者腫瘤直徑成負相關(guān)性二者較一致。

下一步研究需深入探討Per2抑制HCC細胞增殖的具體分子機制，從而為以Per2為靶標(biāo)的肝癌早期診斷、術(shù)后復(fù)發(fā)監(jiān)測以及分子靶向治療提供新的理論支持。

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新聞點擊

睡眠呼吸暫停面罩無法遏止心臟病風(fēng)險

據(jù)美國WebMD醫(yī)學(xué)新聞網(wǎng)(2016- 09- 04)報道，由于阻塞性睡眠呼吸暫停而造成的晚上呼吸困難曾長期被認(rèn)為是心血管風(fēng)險增加的原因。然而，最近的一篇研究讓人們對這個關(guān)聯(lián)性產(chǎn)生困惑。用持續(xù)性正壓呼吸器(CPAP)治療可以減輕睡眠呼吸暫停的癥狀，但它無法降低使用者長期的心臟病發(fā)作、腦卒中或心臟相關(guān)死亡的概率。

CPAP是持續(xù)性正壓呼吸器，使用者在晚上睡覺時戴上它，讓他們呼吸較為順暢。

然而，CPAP療法難以堅持，據(jù)這篇研究報道，人們每晚使用CPAP的時間平均只有3 h。

研究結(jié)果顯示，無論是否使用CPAP，心臟相關(guān)死亡、心臟病發(fā)作、腦卒中、短暫缺血性發(fā)作等的發(fā)病率并沒有差異。

為何CPAP對心臟健康沒有益處？Doug McEvoy博士認(rèn)為，以前的觀察性研究可能高估了睡眠呼吸暫停與心血管疾病之間的關(guān)聯(lián)，如果這個關(guān)聯(lián)性比想象的弱，那么阻斷睡眠呼吸暫停對心臟的益處就不會那么大了。

McEvoy博士認(rèn)為，出現(xiàn)這個研究結(jié)果的原因還可能是因為有許多參與者每晚只使用CPAP 3 h，或許還沒有長到足以帶給心臟益處。

吸煙與克隆病術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險有關(guān)

據(jù)美國WebMD醫(yī)學(xué)新聞網(wǎng)(2016- 09- 09)報道，有新的研究顯示，吸煙增加了克隆病患者腸手術(shù)后的復(fù)發(fā)風(fēng)險。

這篇研究包括了英國240名克隆病患者，于他們進行腸手術(shù)后追蹤3年；研究者指出，克隆病發(fā)生于免疫系統(tǒng)攻擊腸道內(nèi)膜，引起嚴(yán)重炎性反應(yīng)，可能會導(dǎo)致腹瀉、腹痛、惡心與食欲降低。

一開始通常會使用抑制免疫系統(tǒng)的藥物治療這類患者，但是，研究人員認(rèn)為，超過半數(shù)的克隆病患者最后進行了手術(shù)移除受感染的腸段，然而，手術(shù)無法根治克隆病，常會復(fù)發(fā)。

愛丁堡大學(xué)的研究者認(rèn)為，吸煙者比不吸煙者更容易在術(shù)后復(fù)發(fā)。

研究者還評估了稱為硫嘌呤的這類藥物(如mercaptopurine，商品名 Purinethol與Purixan)是否可有效預(yù)防術(shù)后復(fù)發(fā)。研究發(fā)現(xiàn)，這類常被用于治療克隆病的藥物確實可降低吸煙者的復(fù)發(fā)風(fēng)險，但是不適用于非吸煙者。

研究人員認(rèn)為，研究結(jié)果提示吸煙的克隆病患者在術(shù)后應(yīng)立即給予硫嘌呤類藥物，但對于非吸煙者并無證據(jù)支持使用這些藥物。

研究作者Jack Satsangi認(rèn)為，他們的研究確認(rèn)了對克隆病患者健康有益的一件重要事情：不要吸煙。

Satsangi指出，對于進行腸手術(shù)的非吸煙者，第一年的最佳方法是密切觀察，而非立即給予藥物治療。

這篇研究發(fā)表于2016- 08- 30《柳葉刀·胃腸肝病學(xué)》。