劉衍冬，金 偉，鄧琴琴，裴兆輝

(南昌市第三醫(yī)院 心血管內(nèi)科， 江西 南昌 330006)

吸煙嚴(yán)重危害人類健康，香煙煙霧會(huì)導(dǎo)致遺傳毒性和致突變效應(yīng)[1- 2]，但香煙煙霧成分對(duì)心肌結(jié)構(gòu)和功能影響的機(jī)制研究很少。最近報(bào)道，一種主要存在于香煙煙霧中的污染物α，β-不飽和醛能損傷心肌細(xì)胞[3]，其機(jī)制仍不太清楚。本文研究巴豆醛，一種存在于香煙煙霧中的主要α，β-不飽和醛和脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物，對(duì)小鼠心肌細(xì)胞收縮功能的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物：6～8周齡雄性SPF級(jí)C57BL/6小鼠，體質(zhì)量18～25 g[湖南省斯萊克景達(dá)有限公司，許可證號(hào)：SYXK(贛)2010- 0002]。

1.1.2 主要試劑：巴豆醛(西亞試劑公司)；Na+-Ca2+交換體抗體和GAPDH抗體(Santa Cruz公司)；BCA蛋白測(cè)定試劑盒(APPLYGEN公司)；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑(Thermo Scientific公司)；fura- 2/AM(Invitrogen公司)；其他分析純購(gòu)買于天津大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 方法

1.2.1 小鼠心肌細(xì)胞的分離和藥物處理：常規(guī)麻醉小鼠后，取出心臟懸掛于Langendorff裝置上用KHB緩沖液灌注(mmol/L)：118 NaCl，4.7 KCl，1.2 MgSO4，1.2 KH2PO4，25 NaHCO3，10 HEPES，11.1 Glucose。具體步驟參照文獻(xiàn)[4]。分離出的小鼠心肌細(xì)胞與不同濃度(1、10、25和50 μmol/L)巴豆醛孵育6 h，對(duì)照組不經(jīng)巴豆醛處理，所有實(shí)驗(yàn)在環(huán)境溫度25 ℃下進(jìn)行。

1.2.2 心肌細(xì)胞收縮/舒張功能的測(cè)定：用SoftEdge MyoCam系統(tǒng)檢測(cè)心肌細(xì)胞的機(jī)械功能，具體步驟參照文獻(xiàn)[4]，分別檢測(cè)心肌細(xì)胞收縮峰值(peak shortening，PS)、收縮峰值時(shí)間(time-to-PS，TPS)、舒張90%時(shí)間(time-to-90% relengthning，TR90)以及最大收縮/舒張速率(maximal velocity of shortening/relengthening，±dL/dt)。

1.2.3 心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+功能的測(cè)定：將fura- 2/AM(0.5 μmol/L)與小鼠心肌細(xì)胞在室溫下避光孵育10 min，用雙激發(fā)熒光光電倍增系統(tǒng)檢測(cè)熒光信號(hào)，具體步驟參照文獻(xiàn)[5]。細(xì)胞內(nèi)的游離Ca2+熒光指示劑被激發(fā)，其在480 nm和520 nm處波長(zhǎng)熒光下記錄fura- 2熒光強(qiáng)度(fura- 2 fluorescence intensity，F(xiàn)FI)、ΔFFI，熒光延遲時(shí)間用細(xì)胞內(nèi)Ca2+的清除率來(lái)衡量。

1.2.4 SERCA45Ca2+攝取的測(cè)定：小鼠心肌細(xì)胞經(jīng)不同濃度(1、10、25和50 μmol/L)巴豆醛處理6 h后，制作心肌細(xì)胞勻漿并溶解在勻漿緩沖液中：30 mmol/L Tris-HCl，8%蔗糖，1 mmol/L PMSF和2 mmol/L二硫蘇糖醇。心肌細(xì)胞與SERCA抑制劑毒胡蘿卜素(10 μmol/L)一起孵育15 min，加與未加毒胡蘿卜素濾膜放射性之差為毒胡蘿卜素依賴的SERCA45Ca2+攝取量。具體步驟參照文獻(xiàn)[6]。

1.2.5 Western blot檢測(cè)Na+-Ca2+交換體蛋白：心肌細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞裂解液裂解后提取總蛋白，按BCA法檢測(cè)蛋白濃度。取等量蛋白樣品，SDS-PAGE膠電泳后將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉后，加入按相應(yīng)比例稀釋Na+-Ca2+交換體抗體及內(nèi)參GAPDH抗體，4 ℃孵育過夜。經(jīng)TBST洗膜除去過量的一抗，然后加入二抗，室溫孵育2 h，TBST洗膜。最后ECL發(fā)光顯影，采用Image LabTM軟件分析曝光條帶吸光度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同濃度巴豆醛對(duì)小鼠心肌細(xì)胞收縮功能的影響

巴豆醛對(duì)小鼠心肌細(xì)胞的整體形態(tài)無(wú)明顯影響(圖1)。與對(duì)照組相比，25和50 μmol/L的巴豆醛能明顯降低小鼠心肌細(xì)胞PS和±dL/dt(P<0.05)，并能延長(zhǎng)TR90(P<0.05)(圖2)。

2.2 不同濃度巴豆醛對(duì)小鼠心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+功能的影響

與對(duì)照組相比，25和50 μmol/L的巴豆醛能明顯減少小鼠心肌細(xì)胞內(nèi)ΔFFI和延緩心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+衰減(P<0.05)，但不影響靜息和峰值心肌細(xì)胞內(nèi)FFI(圖3)。

2.3 不同濃度巴豆醛對(duì)小鼠心肌細(xì)胞內(nèi)SERCA 45Ca2+攝取及Na+-Ca2+交換體的影響

與對(duì)照組相比，較高濃度巴豆醛(25和50 μmol/L)能抑制小鼠心肌細(xì)胞SERCA活性(P<0.05)，而低濃度巴豆醛(1和10 μmol/L)對(duì)SERCA活性無(wú)抑制作用(圖4A)；巴豆醛對(duì)小鼠心肌細(xì)胞Na+-Ca2+交換體的表達(dá)無(wú)明顯影響(圖4B)。

3 討論

香煙煙霧中的α，β-不飽和醛被認(rèn)為是慢性吸煙誘發(fā)的組織器官損傷的主要因素之一[7- 8]。巴豆醛是一種重要的α，β-不飽和醛，它能與呼吸道黏液系統(tǒng)或細(xì)胞大分子物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)[9]。

本研究采用單個(gè)小鼠心肌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其優(yōu)點(diǎn)是能準(zhǔn)確地控制心肌細(xì)胞所處的外環(huán)境，避免來(lái)自周圍成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞代謝和擴(kuò)散屏障的干擾[5]。小鼠心肌細(xì)胞與不同濃度巴豆醛孵育6 h后，并不影響小鼠心肌細(xì)胞的整體形態(tài)，但它能明顯降低心肌細(xì)胞PS、±dL/dt和細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放，并延長(zhǎng)心肌細(xì)胞TR90和延緩細(xì)胞內(nèi)Ca2+衰減，導(dǎo)致小鼠心肌細(xì)胞收縮/舒張功能損害和細(xì)胞內(nèi)Ca2+功能異常。

圖1 不同濃度巴豆醛對(duì)小鼠心肌細(xì)胞形態(tài)的影響Fig 1 Effect of crotonaldehyde with different concentrations on cardiomyocytes morphology in mouse(×200)

A.resting cell length; B.peak shortening (% of resting cell length); C.maximal velocity of shortening (+dL/dt); D.maximal velocity of relengthening (-dL/dt); E.time-to-peak shortening (TPS); F.time-to-90% relengthening (TR90);*P<0.05 compared with control group

圖2不同濃度巴豆醛對(duì)小鼠心肌細(xì)胞收縮/舒張功能的影響

A.resting fura- 2 fluorescence intensity (FFI); B.peak FFI; C.increase of FFI (ΔFFI) in response to electrical stimuli; D.intracellular Ca2+decay;*P<0.05 compared with control group

圖3不同濃度巴豆醛對(duì)小鼠心肌細(xì)胞Ca2+功能的影響

A.SERCA activity measured by45Ca2+uptake; B.Na+-Ca2+exchanger expression; Inset: representative gel bots depicting expression of Na+-Ca2+exchanger and GAPDH;*P<0.05 compared with control group

圖4不同濃度巴豆醛對(duì)小鼠心肌細(xì)胞Na+-Ca2+交換體表達(dá)及SERCA45Ca2+攝取的影響

長(zhǎng)期給小鼠喂食丙烯醛(一種α，β-不飽和醛)誘導(dǎo)小鼠擴(kuò)張型心肌病后，小鼠左心室明顯擴(kuò)張，并且其左室收縮功能及舒張功能明顯受損[3]，這與本結(jié)果相一致。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)，巴豆醛能抑制心肌細(xì)胞SERCA功能而不影響Na+-Ca2+交換體的表達(dá)，從而影響心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)。心肌細(xì)胞經(jīng)巴豆醛處理后其收縮能力減弱是由于巴豆醛影響了心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)，香煙煙霧可通過引起心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+紊亂導(dǎo)致小鼠心臟收縮功能障礙[4]，提示心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+紊亂是巴豆醛誘導(dǎo)小鼠心肌收縮功能障礙的重要機(jī)制。SERCA和Na+-Ca2+交換體在心肌舒張期時(shí)將細(xì)胞質(zhì)中的Ca2+轉(zhuǎn)入到細(xì)胞外發(fā)揮重要作用[10- 11]。本實(shí)驗(yàn)觀察到巴豆醛能明顯降低SERCA活性，導(dǎo)致肌漿網(wǎng)(SR)對(duì)Ca2+攝取降低，從而細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加，引起心肌舒張功能障礙(延長(zhǎng)心肌細(xì)胞TR90和延緩細(xì)胞內(nèi)Ca2+衰退)。已證實(shí)氧自由基通過抑制L型Ca2+電流、Na+-Ca2+交換和SR Ca2+攝取而破壞心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)[12- 14]，進(jìn)而影響心肌細(xì)胞收縮功能。因此，巴豆醛可能還通過氧化應(yīng)激來(lái)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞心臟收縮功能障礙。下一步筆者將針對(duì)巴豆醛誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激揭示巴豆醛誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的另一機(jī)制。

綜上所述，巴豆醛可抑制小鼠心肌細(xì)胞內(nèi)SERCA活性，導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+功能異常，從而抑制心肌細(xì)胞的收縮功能。

[1] Gvinianidze K, Tsereteli D. Tobacco smoking attributable mortality and years of potential life lost in Georgia[J]. Georgian Med News, 2012, 206: 52- 57.

[2] 劉京男，周彩存，樸紅梅，等. GSTT1基因型和吸煙狀況與肺癌易感性關(guān)系[J]. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床, 2012, 32: 1194- 1197.

[3] Ismahil MA, Hamid T, Haberzettl P,etal. Chronic oral exposure to the aldehyde pollutant acrolein induces dilated cardiomyopathy[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2011, 301: H2050- H2060.

[4] Hu N, Han X, Lane EK,etal. Cardiac-specific overexpression of metallothionein rescues against cigarette smok-ing exposure-induced myocardial contractile and mitochondrial damage[J]. PLoS One, 2013, 8: e57151.doi:10.1371/journal.pone.0057151.

[5] Wold LE, Ren J. Mechanical measurement of contractile function of isolated ventricular myocytes[J]. Methods Mol Med, 2007, 139: 263- 270.

[6] Ge W, Guo R, Ren J. AMP-dependent kinase and autophagic flux are involved in aldehyde dehydrogenase- 2-induced protection against cardiac toxicity of ethanol[J]. Free Radic Biol Med, 2011, 51: 1736- 1748.

[7] Haussmann HJ. Use of hazard indices for a theoretical evaluation of cigarette smoke composition[J]. Chem Res Toxicol, 2012, 25: 794- 810.

[8] Bein K, Leikauf GD. Acrolein-a pulmonary hazard[J]. Mol Nutr Food Res, 2011, 55: 1342- 1360.

[9] Nair U, Bartsch H, Nair J. Lipid peroxidation-induced DNA damage in cancer-prone inflammatory diseases: a review of published adduct types and levels in humans[J]. Free Radic Biol Med, 2007, 43: 1109- 1120.

[10] Cui C, Merritt R, Fu L,etal. Targeting calcium signal-ing in cancer therapy[J]. Acta Pharm Sin B, 2017, 7: 3- 17.

[11] Birkeland JA, Sejersted OM, Taraldsen T,etal. EC-coupling in normal and failing hearts[J]. Scand Cardiovasc J, 2005, 39: 13- 23.

[12] 陳少青，崔曉雪，龍杰，等. 氧化應(yīng)激對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞網(wǎng)腔鈣結(jié)合蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及信號(hào)傳導(dǎo)通路作用的研究[J]. 臨床心血管病雜志, 2016, 6: 611- 613.

[13] 李青，李菊香. 心肌興奮-收縮偶聯(lián)在心力衰竭中的研究進(jìn)展[J]. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床, 2014, 34: 1129- 1132.

[14] Hafstad AD, Nabeebaccus AA, Shah AM. Novel aspects of ROS signalling in heart failure[J]. Basic Res Cardiol, 2013, 108: 359.