劉俊雅，范姝婕，黃 薇，楊 楠，劉雁勇

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)學(xué)院 藥理學(xué)系， 北京 100005)

胰腺癌是一種惡性程度極高的腫瘤，約90%的胰腺癌為起源于腺管上皮的導(dǎo)管腺癌。胰腺癌是預(yù)后最差的惡性腫瘤，該病患者的5年生存率不足5%[1- 2]。盡管在過去的20年間人們付出很大努力，其發(fā)病率和病死率近年來仍明顯上升。預(yù)計到2030年，胰腺癌將成為全球第2位癌相關(guān)的死因[3]。胰腺癌臨床治療20年來未有大的進展，其發(fā)生發(fā)展機制有待深入研究。熱休克蛋白(heat shock protein，Hsp)是生物界中廣泛存在的一類具有高度保守性的蛋白質(zhì)，當(dāng)細胞受到不利因素(如缺血、缺氧等)刺激時，它能迅速大量合成，并與客戶蛋白結(jié)合以調(diào)節(jié)其結(jié)構(gòu)及功能。作為熱休克蛋白家族的重要一員，Hsp90除了參與蛋白質(zhì)的折疊、運輸?shù)冗^程，其客戶蛋白還包括一系列在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用的腫瘤相關(guān)蛋白[4]，影響腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的多種信號傳導(dǎo)途徑。本研究應(yīng)用組織芯片的免疫組化方法，分析Hsp90在胰腺癌腫瘤組織及癌旁組織中表達情況，為Hsp90作為胰腺癌潛在的治療靶標提供實驗和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例：共包括63例胰腺癌患者組織標本(胰腺癌組織芯片)，本實驗獲得有效染色樣本共62例(編號為D20A0273的標本缺失，本實驗未予分析)。其中男36例，女26例，年齡范圍在41～85 歲，平均年齡為66歲。參照AJCC第7版制定的標準，去除無臨床分期病例，1期5例，2期45例，4期4例；組織病理分級Ⅰ-Ⅱ 10例，Ⅱ 26例，Ⅱ-Ⅲ 26例；去除無TNM分期病例，T1-T2分期9例，T3分期37例；去除無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)病例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)小于3的16例，轉(zhuǎn)移數(shù)大于11的13例。所有病例均無同時患其他惡性腫瘤，患者手術(shù)前均未經(jīng)放、化療。

1.1.2 主要試劑與材料：胰腺癌組織芯片(上海芯超生物科技有限公司)；兔抗人Hsp90單克隆抗體(Cell Signaling公司)；通用型免疫組化二步法檢測試劑盒、乙二胺四乙酸(EDTA)抗原修復(fù)液和DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；其他試劑(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 方法

免疫組化檢測Hsp90表達：胰腺癌組織芯片脫蠟，PBS緩沖液沖洗3遍，EDTA抗原修復(fù)液在95 ℃進行抗原修復(fù)15 min、參照通用型免疫組化二步法檢測試劑盒使用說明操作。高倍顯微鏡下觀察Hsp90在各例標本的腫瘤與癌旁組織中表達情況。Hsp90染色陽性判斷為鏡下組織結(jié)構(gòu)完整、清晰、定位明確、胞質(zhì)和(或)胞核為棕黃色，染色明顯高于背景者。40倍物鏡下，在胰腺癌組織芯片上的每個組織點任選3個視野，拍攝照片，用 IPP 6.0軟件通過宏處理進行吸光度值分析。測定每個組織點的選擇區(qū)域(area)的面積及該特定區(qū)域的累積吸光度值(IA)，并將這3個視野的累積吸光度值之和除以區(qū)域之和，然后計算得出一個代表每個芯片組織點的平均吸光度值(mean optical density=IASUM/area SUM)，以作為該組織點的測量值。該吸光度值的高低與蛋白表達量多少呈正比。實驗操作和拍照統(tǒng)計過程的每一步都嚴格統(tǒng)一控制，以保證各個組織點的操作處理條件相同。最后，統(tǒng)一對其平均吸光度值的平均值與標準差進行統(tǒng)計分析，以分析各個指標之間的相互關(guān)系。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用GraphPad Prism 6.0 統(tǒng)計軟件進行分析，采用ANOVA或者t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 胰腺癌組織芯片免疫組化染色結(jié)果

免疫組化染色后的胰腺癌組織芯片陣列排列(圖1A)，3例代表性胰腺癌病理標本免疫組化圖(圖1B)和Hsp90表達量與臨床病理指標的關(guān)系(圖1C)。

2.2 Hsp90在胰腺癌組織中的表達水平與臨床病理指標的關(guān)系

本實驗比較了Hsp90在相應(yīng)的癌與癌旁組織中的表達與病理分級、臨床分期、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)、年齡和性別的關(guān)系(表1)。Hsp90在Ⅱ-Ⅲ級胰腺癌組織中表達量明顯高于Ⅰ-Ⅱ級(P<0.05)；胰腺癌臨床晚期的組織中Hsp90表達水平更高，臨床2期胰腺癌組織中的表達量明顯高于1期(P<0.05)；T3分期癌組織的Hsp90表達量也高于T1-T2分期(P<0.05)；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)多的胰腺癌組織具有相對較高的Hsp90表達水平(P<0.05)。

A.a-h.1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, i1, i3 and i5-i8 are pancreatic cancer tissues; a-h.2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, i2 and i4 are para-carcinoma tissues; B.expressions of Hsp90 in 3 cases of typical pathological specimens; presented in the coHesponding position of figure A;C.a, b.relative expression of Hsp90 in different histologic grades of the pancreatic cancer and para-carcinoma;*P<0.05 compared with Ⅰ-Ⅱ; c, d.relative expression of Hsp90 in different AJCC phases of the pancreatic cancer and para-carcinoma; 1,2,4 represents the AJCC phase 1, phase2, phase3, respectively;*P<0.05 compared with phase 1; e, f.relative expression of Hsp90 in different T phases of the pancreatic cancer and para-carcinoma;*P<0.05 compared with phase T1-T2; g, h.relative expression of Hsp90 in different numbers of lymph nodes;*P<0.05 compared with lymph node metastasis number less than 3; i, j.relative expression of Hsp90 in different ages of the pancreatic cancer and para-carcinoma; k, l.relative expression of Hsp90 in different genders of the pancreatic cancer and para-carcinoma

圖1 胰腺癌組織芯片陣列排列示意圖、3例代表性病理標本的免疫組化圖和胰腺癌組織的Hsp90表達量與臨床病理指標的關(guān)系

*P<0.05 compared with para-carcinoma.

2.3 Hsp90在胰腺癌組織中的表達水平與患者生存期的關(guān)系

胰腺癌組織中Hsp90表達量高的患者生存期略短(圖2A)，平均13.8個月，而胰腺癌組織中Hsp90表達量低的患者生存期則為21.5個月。胰腺癌旁組織中Hsp90表達量與患者生存期的關(guān)系見圖2B。

A.relationship between relative expression of Hsp90 and the patient survival curve in pancreatic cancer tissues; B.relationship between relative expression of Hsp90 and the patient survival curve in para-carcinoma tissues圖2 胰腺癌組織的Hsp90表達量與患者生存期的關(guān)系Fig 2 Relationship between expression of Hsp90 and the patient survival in pancreatic cancer tissues

3 討論

熱休克蛋白是廣泛存在于生物界中具有高度保守性質(zhì)的多肽類蛋白質(zhì)，作為伴侶蛋白，它參與靶蛋白的合成、積聚、折疊、裝配、運輸和降解等過程[5]。Hsps是一個大的蛋白質(zhì)超家族，根據(jù)分子質(zhì)量的大小可將該家族分為6類：大分子熱休克蛋白(100～110 ku)、Hsp90(83～93 ku)、Hsp70(66～78 ku)、Hsp60(60 ku)、Hsp40(40 ku)以及小分子熱休克蛋白(15～30 ku)[6]。作為細胞內(nèi)最重要的分子伴侶之一，Hsp90在許多腫瘤中的表達水平升高，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[4]。它在多種腫瘤中的客戶端癌基因蛋白的激活、穩(wěn)定、折疊、聚合、水解和轉(zhuǎn)運等過程中扮演重要角色[7]。總的來說，抑制Hsp90可以通過影響多條信號通路而發(fā)揮抗腫瘤作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，高表達的Hsp90與黑色素瘤、肝癌等預(yù)后不良密切相關(guān)[8- 9]，表明Hsp90可能作為一種重要的信號元件參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展進程。

本研究發(fā)現(xiàn)63例胰腺癌標本中Hsp90在胰腺癌組織中高表達，而癌旁中的Hsp90表達量低于癌組織。Hsp90在胰腺癌中的過度表達可能是因為腫瘤細胞無限增殖過程需要大量的Hsp90維持穩(wěn)定，并且腫瘤造成的應(yīng)激環(huán)境也會誘導(dǎo)Hsp90的過度表達。作為一個全新的腫瘤廣譜標志物，Hsp90可用來協(xié)助探討相關(guān)疾病的發(fā)病機理及患者的治療、預(yù)后等，如檢測多發(fā)性骨髓瘤患者血清中Hsp90的表達情況[10]。自格爾德霉素在 1992年作為第一個Hsp90抑制劑被發(fā)現(xiàn)以來[11]，越來越多的其他相關(guān)的抑制劑被開發(fā)并陸續(xù)進入到臨床研究階段，如 Hsp90抑制劑阿螺旋霉素用于晚期實體腫瘤患者的臨床Ⅰ期試驗并取得了初步成果[12]，這間接證實了Hsp90在多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用。本實驗結(jié)果顯示Hsp90的表達與病理分級、臨床分期、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)密切相關(guān)，這提示Hsp90作為伴侶蛋白，與胰腺癌的高侵襲、高轉(zhuǎn)移能力具有一定的相關(guān)性?？傊狙芯客ㄟ^免疫組化法初步分析了 Hsp90在63例胰腺癌患者標本中的表達情況，這為以后尋找胰腺癌早期診斷、治療及臨床預(yù)后評估的分子標志物提供了有價值的參考資料。Hsp90對胰腺癌患者的臨床意義有待更深入的研究證實。

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