劉雅婷，李 鑫，王 娜，宋飛雪

(蘭州大學(xué)第二醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科， 甘肅 蘭州 730000)

在腫瘤發(fā)展的早期，氧氣是限制腫瘤生長的因素，其主要原因在于早期腫瘤細胞快速增殖，導(dǎo)致腫瘤內(nèi)部氧氣的供應(yīng)小于消耗，造成低氧，此時細胞還未激活腫瘤細胞抗低氧基因和相關(guān)信號通路，例如HIF- α、糖酵解和侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因[1]。當(dāng)腫瘤發(fā)展至后期時，低氧微環(huán)境可以促進腫瘤的生長，目前研究發(fā)現(xiàn)促進作用可以通過多種途徑實現(xiàn)，低氧可以誘導(dǎo)HIF- α表達升高，激活腫瘤細胞發(fā)生自噬，通過“吃自己”抵抗低氧引起的營養(yǎng)供應(yīng)不足[2]，激活血管生成，轉(zhuǎn)變腫瘤細胞的供能方式，由氧化磷酸化為主向糖酵解為主轉(zhuǎn)變[3]，提高腫瘤細胞的侵襲能力[4]。在前期研究中發(fā)現(xiàn)低氧可通過啟動凋亡抑制SW480細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移，通過啟動自噬保護CD133+免于凋亡[5]，其具體的分子機制并未被闡釋，本實驗將對低氧引起的這種在不同細胞類型上的自噬差異進行初步的探索，為臨床治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系：人結(jié)腸癌細胞系SW480(中國科學(xué)院上海生物研究所)；CD133+細胞(磁珠分選SW480細胞中CD133表達陽性亞群)；人結(jié)腸癌組織：收集甘肅省人民醫(yī)院病理科2008年6月至2009年9月手術(shù)切除的94例結(jié)直腸癌標(biāo)本。其中男性56例，女性38例，年齡27～ 80歲，中位年齡56歲。按照2000年版世界衛(wèi)生組織消化系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)對以上標(biāo)本進行組織學(xué)分型和病理分級，其中，1)按Duke’s分期：A期2例；B期53例；C期34例；D期5例。2)按組織學(xué)類型：Ⅰ級，高分化管狀和乳頭狀腺癌1例；Ⅱ級，中分化腺癌67例；Ⅲ級，低分化腺癌和印戒細胞癌26例。3)按部位：結(jié)腸癌16例，直腸癌78例。4)按有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：有轉(zhuǎn)移42例，無轉(zhuǎn)移52例。

1.1.2 主要試劑:細胞培養(yǎng)基DMEM/F12(PeproTech公司)；新生牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；CD133磁性微珠(Miltenyi公司)；B27(Sigma公司)；bFGF(PeproTech公司)；EGF(Gibco公司)；抗HIF- 2α抗體(武漢博士德生物工程有限公司)；SP9001免疫組化試劑盒(中杉金橋公司)，Western blot所有抗體(Solarbio公司)。

1.2 方法

1.2.1 免疫磁珠分選SW480細胞：取10瓶常規(guī)培養(yǎng)的處于對數(shù)增殖期SW480 細胞(細胞數(shù)為107個)，按免疫磁珠分選說明書進行分選，將分選后得到的CD133+細胞與未分選的SW480行常規(guī)培養(yǎng)和低氧(1% O2)培養(yǎng)，其中CD133+細胞培養(yǎng)于含 2% B27、 20 μg/L bFGF、20μg/L EGF的 DMEM/F12培養(yǎng)基中，每3 d加液1次，分別于分選后 0、7和14 d倒置顯微鏡觀察細胞增殖情況。

1.2.2 免疫熒光檢測HIF- 2α表達：取對數(shù)增殖期細胞，用0.25%胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液。將細胞接種到預(yù)先處理好的6孔板中的蓋玻片上，孵箱培養(yǎng)1 d，待細胞貼壁后分別在正常氧含量及低氧含量的微環(huán)境中培養(yǎng)48 h，取出蓋玻片，浸入PBS洗2次，每次5 min，95%乙醇固定10 min；PBS洗3次，每次5 min，0.2% Triton- 100透化30 min；PBS洗滌3次，每次5 min，5% BSA室溫封閉30 min；加入一抗放在濕盒里4℃過夜，取出37 ℃孵育45 min；PBS洗滌3次，每次5 min，加入二抗30 min避光；PBS洗滌3次，每次5 min，加入DAPI避光30 min；PBS洗滌3次，每次5 min，95%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察，陽性細胞將在胞質(zhì)及胞膜處出現(xiàn)綠色熒光。

1.2.3 Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白LC3的表達：取預(yù)處理的SW480及CD133+細胞，消化后，收集于2 mL離心管中，PBS低溫離心洗滌后，置于冰上，每組加入200 μL細胞裂解液，再加入10 μL/mL 的PMSF，吹打均勻，超聲波破碎，每組細胞重復(fù)10次，然后渦旋振蕩15 s，冰上放置10 min，重復(fù)3次。恒溫離心機溫度控制于4 ℃、15 000 r/min離心30 min，收集上清，得到蛋白裂解液，最后進行分裝，每管50 μL，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。利用Bradford法測定各組蛋白含量后，取出已經(jīng)分裝好的蛋白，加入5×上樣緩沖液，沸水中煮10 min，冷卻后加入預(yù)先制好的SDS-PAGE凝膠中，進行電泳，待其電泳完成后，將分離的蛋白樣品轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，封閉后，進行免疫印跡雜交，其中GAPDH抗體1∶1 000稀釋，LC3抗體1∶1 500稀釋。顯影之后的膠片利用計算機進行掃描，再利用IPWIin51軟件分析，對每個條帶進行定量，最終將圖像的觀察轉(zhuǎn)為定量的結(jié)果。

1.2.4 免疫組化染色檢測HIF- 2α和Beclin的表達：組織切片60 ℃恒溫箱中烤片過夜，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，溫水漂洗，蒸餾水浸泡，檸檬酸鈉修復(fù)，自然冷卻，蒸餾水沖洗，然后按免疫組化試劑盒說明操作。結(jié)果判定：HIF- 2α和Beclin組織切片顯示以胞質(zhì)染色為淡黃色至棕褐色顆粒者為陽性。于光學(xué)顯微鏡下隨機選取3個有代表性的不同視野，每個視野的得分由陽性染色細胞所占面積和細胞染色強度兩者計分之和來判斷。染色面積計分為：陽性染色細胞<5%計0分；5%～25%計1分；26%～50%計2分；>50%計3分。細胞染色強度：不染色計0分；淡黃色計1分；棕黃色計2分；棕褐色計3分。若兩種計分之和≤2，則為陰性表達，>2則為陽性表達。(-)為陰性，(+)為弱陽性表達，(++)～(+++)為強陽性表達。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 低氧微環(huán)境對SW480細胞系HIF- 2α表達的影響

較對照組，低氧環(huán)境可誘導(dǎo)SW480細胞中HIF- 2α的表達上升，并且隨著低氧處理時間的增長，HIF- 2α的表達量不斷增加(圖1)。

2.2 低氧對結(jié)腸癌細胞自噬相關(guān)蛋白LC3的影響

低氧誘導(dǎo)SW480和CD133+細胞中LC3Ⅰ表達增加。但隨著低氧時間增長，SW480細胞中LC3Ⅱ表達逐漸減少，CD133+細胞中LC3Ⅱ表達逐漸增加 (圖2,3)。

2.3 HIF- 2α及Beclin1在結(jié)直腸組織中的表達

2.3.1 HIF- 2α在結(jié)直腸組織中的表達：在結(jié)直腸癌組織中例中，高中分化組HIF- 2α在腫瘤細胞中陽性表達率為60.3%，低分化組HIF- 2α在腫瘤細胞中陽性表達率為84.6%，低分化組HIF- 2α的表達率大于高分化組(P<0.05)；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中HIF- 2α的表達率為52.4%，顯著低于淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組中78.8%(P<0.05)。HIF- 2α的表達與結(jié)直腸癌患者的性別、年齡、浸潤深度、Duke、S分期以及生長部位無明顯相關(guān)性(圖4)。

A .immuhistochemistry;B.statistical analynasis results of A；*P<0.01 compared with control group；△P<0.01 compared with hypoxia 24 hours goup

圖2 低氧對結(jié)腸癌細胞自噬相關(guān)蛋白的影響Fig 2 Effects of hypoxia on colon cancer cell autophagy-related protein

*P<0.05 compared with control group；△P<0.05 compared with hypoxia 24h group圖3 低氧對結(jié)腸癌細胞自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ的影響Fig 3 Effects of hypoxia on colon cancer cell autophagy-related protein LC3Ⅱ

2.3.2 Beclin1在結(jié)直腸癌組織中的表達：在結(jié)直腸癌組織中(94例)中，高中分化組Beclin1的表達率為63.2%，顯著低于低分化組的84.6%(P<0.05)；淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移組中Beclin1的表達率為78.6%高于無轉(zhuǎn)移組中的57.7% (P<0.05)。Duke、s分期的A-B期中Beclin1的表達率為56.4%低于C-D期的82.1%(P<0.01)。Beclin1的表達與結(jié)直腸癌患者的性別、年齡、浸潤深度及生長部位無明顯相關(guān)性(圖4)。

3 討論

低氧作為腫瘤微環(huán)境的一個主要特點，在腫瘤發(fā)展的不同時期起著不同的作用[4]。HIF- α在低氧環(huán)境中最先被誘導(dǎo)表達，激活下游多種細胞抗低氧相關(guān)基因的表達。在結(jié)直腸癌細胞系SW480中，CD133+細胞是一類具有干細胞特性的癌細胞。低氧可以維持CD133+細胞的表型、抑制其向成熟的腫瘤細胞分化[6]。自噬在生物發(fā)育、維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)、衰老等方面起重要作用[7]，但在某些腫瘤細胞中發(fā)現(xiàn)自噬可保護細胞免受凋亡[8]。研究顯示在SW480細胞系中，低氧可誘導(dǎo)大部分SW480細胞死亡，卻能促進CD133+細胞發(fā)生自噬規(guī)避凋亡[5]。

本實驗中，免疫熒光結(jié)果顯示，與常氧環(huán)境中相比，低氧環(huán)境可誘導(dǎo)SW480 細胞中HIF- 2α表達上升并在細胞膜周圍不斷聚集。研究顯示HIF- 2α可激活BNIP3和NIX的轉(zhuǎn)錄，進而抑制Beclin3和Bcl- 2的功能，抑制細胞凋亡。細胞內(nèi)NIX表達WXXL基序，該基序可被LC3識別并結(jié)合[9]，導(dǎo)致產(chǎn)生自噬。Western blot結(jié)果顯示低氧誘導(dǎo)SW480和CD133+細胞中LC3Ⅰ表達增加。但隨著低氧時間增長，SW480細胞中LC3Ⅱ表達逐漸減少，CD133+細胞中LC3Ⅱ表達逐漸增加，表明導(dǎo)致在低氧環(huán)境中CD133+細胞存活能力強的原因在于自噬的增強。

圖4 Beclin1和HIF- 2α在結(jié)腸癌組織中的陽性表達Fig 4 Positive expression of Becline1 and HIF- 2α in colorectal carcinoma

本實驗選取HIF- 2α及Beclin1，觀察二者在結(jié)腸癌組織中的表達。在結(jié)腸癌組織學(xué)實驗中，HIF- 2α的表達率在低分化組中高于高分化組，在淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組中高于淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移組。Beclin1表達率在低分化組高于高分化組，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。Duke、S分期中，Beclin1陽性表達率C-D期高于A-B期(P<0.05)。而HIF- 2α和Beclin1的表達與結(jié)直腸癌患者的性別、年齡、浸潤深度及生長部位不相關(guān)。HIF- 2α在低氧時會聚集，雖然之前有報道提示HIF- 2α的表達在腫瘤組織中會受限[10]，但在本實驗中高表達。隨著結(jié)腸癌組織分化程度的降低惡性度越高，組織發(fā)生缺氧程度越高，自噬水平越高；低氧微環(huán)境及自噬在結(jié)腸癌發(fā)生中可能具有促進作用。

綜上可知低氧可引起SW480細胞HIF的升高，促進LC3的表達，從而啟動大部分SW480細胞自噬性凋亡，但對于SW480細胞中一小部分CD133+細胞，由低氧引起的自噬并不能使其發(fā)生凋亡，而是通過自噬將細胞器降解，為癌細胞存活提供營養(yǎng)物質(zhì)。

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