王 寧，胡志芳，李愛連，姜鳳良

(西安醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)教研室， 陜西 西安 710021)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種多關(guān)節(jié)滑膜炎性反應(yīng)為特點(diǎn)的自身免疫性疾病[1]。雞Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis, CIA)小鼠為人類RA研究的經(jīng)典動(dòng)物模型[2]。濾泡輔助性T(T follicular helper，Tfh)細(xì)胞可促進(jìn)淋巴濾泡生發(fā)中心的形成、B淋巴細(xì)胞的發(fā)育和高親和力抗體的產(chǎn)生，高表達(dá)趨化因子受體(C-X-C chemokine receptor type，CXCR)5和協(xié)同刺激性因子(inducible costimulatory，ICOS)，而濾泡調(diào)節(jié)性T(T follicular regulatory，Tfr)細(xì)胞表達(dá)叉頭盒蛋白3(forkhead/winged-helix transcription factor box P3, Foxp3)、CXCR5和ICOS，通過抑制Tfh細(xì)胞活性、生發(fā)中心 B 細(xì)胞的類別轉(zhuǎn)換和抗體分泌來維持機(jī)體免疫耐受[3]。因此，Tfh和Tfr細(xì)胞數(shù)量及其比例變化與機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)維持和自身免疫性疾病發(fā)生均有密切關(guān)系。本研究旨在評估Tfh和Tfr細(xì)胞數(shù)量、比例與CIA病程相關(guān)性，探討其在RA發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑：雞Ⅱ型膠原和完全弗氏佐劑(Sigma公司)；RPMI 1640(Hyclone公司)，胎牛血清(浙江四季青公司)，小鼠淋巴細(xì)胞分離液(深圳達(dá)科為公司)，青鏈霉素混合液(北京博艾爾公司)，小鼠Percp-CD4、PE-CXCR5、APC-ICOS、Alexa Fluor 488-Foxp3熒光抗體和IgG同型抗體(Biolegend公司)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級C57BL/6雄性小鼠60只，6～8周齡，體質(zhì)量為20.0±0.5 g(第四軍醫(yī)大學(xué))，許可證編號(hào)XJYYLL- 2014435。

1.2 方法

1.2.1 小鼠分組及處理：將小鼠分為對照組、CIA病程早期組、中期組和晚期組共4組，每組各15只。將雞Ⅱ型膠原(ColⅡ)溶解于0.01 mol/L冰醋酸中，混勻后4 ℃過夜，將完全弗氏佐劑(CFA)與Col Ⅱ等體積混合，研磨至油包水狀態(tài)。麻醉小鼠后尾跟部皮下注射100 μL。首次免疫后第21天相同方法和劑量進(jìn)行2次加強(qiáng)免疫。對照組小鼠按照上述方法和時(shí)間注入等量0.9%氯化鈉溶液。ColⅡ免疫組小鼠足關(guān)節(jié)紅腫變形，提示造模成功。造模后進(jìn)行疾病觀察并進(jìn)行病情評估，確定再次免疫后8～12 d為病程早期，22～26 d為病程中期，30～35 d為病程晚期，分別處死小鼠，分離脾臟和外周淋巴結(jié)。

1.2.2 小鼠病情和關(guān)節(jié)AI評分：每日觀察足爪關(guān)節(jié)腫脹情況，用關(guān)節(jié)炎指數(shù)(arthritis index, AI)衡量病變情況，病變程度參考以下評分[7]。0級：關(guān)節(jié)正常，無紅腫；1級：關(guān)節(jié)紅但無腫大；2級：關(guān)節(jié)輕度紅腫；3級：關(guān)節(jié)中度紅腫；4級：關(guān)節(jié)重度紅腫伴隨功能障礙。每只小鼠病情評分為其四肢關(guān)節(jié)分?jǐn)?shù)的總和。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測病情高峰期小鼠脾臟和淋巴結(jié)Tfh細(xì)胞： 制備脾臟和淋巴結(jié)單細(xì)胞懸液5×106個(gè)細(xì)胞，利用錐蟲藍(lán)拒染法確定活細(xì)胞>95%。Tfr和Tfh細(xì)胞數(shù)量和比例測定：收集各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞量并去除培養(yǎng)基，分別加入：Percp-CD4抗體1.25 μL、PE-CXCR5抗體2.5 μL、APC-ICOS抗體2.5 μL和Alexa Fluor 488-Foxp3抗體2.5 μL，設(shè)置同型管和補(bǔ)償管；混勻，4 ℃放置30 min后徹底洗滌，加200 μL甲醛固定液保存待上機(jī)，所測結(jié)果使用FlowJo 10軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 CIA小鼠病情評估: 加強(qiáng)免疫后CIA小鼠出現(xiàn)活動(dòng)力

降低、進(jìn)食減少和體質(zhì)量下降，尾根部皮膚漸紅腫潰瘍，背部皮膚出現(xiàn)片狀潰瘍；疾病早期AI指數(shù)為(1.93±1.32)；疾病中期為(5.73±2.12)；疾病晚期為(3.14±1.58)。

2.2 CIA小鼠病程中期和晚期脾臟、淋巴結(jié)Tfr細(xì)胞比例變化:CIA小鼠病程中期脾臟Tfr細(xì)胞在CD4+T中所占比例明顯低于對照組小鼠(P<0.001)；病程晚期所占比例較中期明顯升高(P<0.01)(圖1,圖2A)。病程中期淋巴結(jié)Tfr細(xì)胞所占比例明顯低于對照組小鼠(P<0.01)；病程晚期所占比例較中期明顯升高(P<0.05)(圖1,圖2B)。

2.3 CIA小鼠病程中期和晚期脾臟、淋巴結(jié)Tfh細(xì)胞比例變化:CIA小鼠病程中期脾臟Tfh細(xì)胞所占比例明顯高于對照組小鼠(P<0.01)，也明顯高于病程中期小鼠；病程晚期較中期明顯降低(P<0.05)(圖1,圖3A)。病程早期淋巴結(jié)中Tfh細(xì)胞較對照組明顯升高(P<0.01)；病程晚期較中期明顯降低(P<0.05)(圖1,圖3B)。

2.4 CIA小鼠病程中期和晚期脾臟、淋巴結(jié)Tfr/Tfh比值的比較:CIA小鼠病程早期脾臟Tfr/Tfh開始低于對照組(P<0.05)；中期明顯降低(P<0.001)；CIA小鼠病程晚期脾臟Tfr/Tfh比值較中期明顯升高(P<0.01)(圖4A)。病程早期淋巴結(jié)Tfr/Tfh明顯降低(P<0.05)，中期降低最為明顯，病程晚期淋巴結(jié)Tfr/Tfh比值較中期明顯升高(P<0.05)(圖4B)。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用人類RA經(jīng)典動(dòng)物模型CIA模型，檢測小鼠RA病程中脾臟和淋巴結(jié)Tfr和Tfh細(xì)胞數(shù)量比例和變化規(guī)律。在病程3個(gè)時(shí)期中，脾臟和淋巴結(jié)中Tfh細(xì)胞比例與AI評分趨勢始終一致，說明Tfh細(xì)胞可能通過激活體液免疫應(yīng)答參與和促進(jìn)RA病程進(jìn)展。此外， Tfr/Tfh穩(wěn)態(tài)對于調(diào)節(jié)生發(fā)中心B細(xì)胞以維持免疫平衡至關(guān)重要[4]。通過檢測RA病程中脾臟和淋巴結(jié)Tfr細(xì)胞比例，明確其與AI評分和Tfh細(xì)胞比例趨勢剛好相反，提示RA病程早期和中期Tfr細(xì)胞數(shù)量比例降低與機(jī)體過強(qiáng)異常免疫應(yīng)答存在密切關(guān)聯(lián)，晚期Tfr細(xì)胞參與對異常體液免疫應(yīng)答的調(diào)控過程以維持免疫穩(wěn)態(tài)。

圖1 各組脾臟和淋巴結(jié)CD4+T 細(xì)胞中Tfr和Tfh細(xì)胞比例Fig 1 The proportion of Tfr and Tfh in CD4+ T cells in spleen and lymph node of each group

A.Tfr percentage in CD4+T cell of spleen between each group; B.Tfr percentage in CD4+T cell of lymph node between each group;*P<0.05，**P<0.001 compared with control group；△P<0.01 compared with early stage group;#P<0.05 compared with middle stage group

A.Tfh percentage in CD4+T cell of spleen between each group; B.Tfh percentage in CD4+T cell of lymph node between each group;*P<0.01 compared with control group；△P<0.01 compared with early stage group;#P<0.05 compared with middle stage group

A.Thr/Tfh ratio in spleen between each group; B.Tfr/Tfh ratio in lymph node between each group;*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001 compared with control group；△P<0.01 compared with early stage group;#P<0.01 compared with middle stage group

本實(shí)驗(yàn)用CIA小鼠系統(tǒng)性對病程中Tfh和Tfr細(xì)胞變化規(guī)律進(jìn)行分析，明確Tfh和Tfr細(xì)胞通過動(dòng)態(tài)調(diào)控參與RA病理進(jìn)程階段，此研究不僅對于評估RA患者體內(nèi)體液應(yīng)答水平具有一定參考價(jià)值，而且為Tfh和Tfr成為可行性細(xì)胞治療靶點(diǎn)提供研究基礎(chǔ)。

[1] Barhamain AS, Magliah RF, Shaheen MH,etal. The journey of rheumatoid arthritis patients: a review of reported lag times from the onset of symptoms[J].Open Access Rheumatol, 2017,28:139- 150.

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