馬德源 范仲學(xué) 郭鳳丹 王能飛 王穎 張斌

摘要：利用從南極土壤中分離篩選的產(chǎn)低溫纖維素酶菌株SC-5，以甜高粱稈為發(fā)酵底物，開展同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)纖維素乙醇試驗研究。結(jié)果表明：SC-5低溫纖維素酶，底物親合性好，最適pH值為6.0，最適作用溫度為40℃，pH適應(yīng)性廣，熱穩(wěn)定性好，乙醇耐受性好。同步發(fā)酵1.0 kg甜高粱稈可生產(chǎn)45 g乙醇，乙醇生產(chǎn)效率較高，發(fā)酵工藝簡單實用。

關(guān)鍵詞：低溫纖維素酶；甜高粱稈；同步發(fā)酵；纖維素乙醇

中圖分類號：S514.099文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2018）02-0139-04

Abstract The strain SC-5 producing low temperature cellulase was isolated from the Antarctic soil. With the sweet sorghum stalks as substrate， the experiment was carried out for simultaneous saccharification and fermentation to produce cellulosic ethanol using SC-5.The results showed that the SC-5 strain had stronger ability to produce low-temperature cellulase， better substrate affinity， wider pH adaptability， better thermostability and tolerance to ethyl alcohol.The optimum pH value was 6.0， and the optimum temperature was 40℃. With SC-5， simultaneous saccharification and fermentation of 1.0 kg of sweet sorghum stalks could produce 45 g of ethanol. All these indicated that the fermentation process was simpler and the production efficiency was higher.

Keywords Low-temperature cellulose；Sweet sorghum stalk； Simultaneous fermentation；Cellulosic ethanol

利用纖維素酶發(fā)酵木質(zhì)纖維素生產(chǎn)燃料乙醇是解決當(dāng)前能源緊張、資源短缺、環(huán)境惡化等現(xiàn)實問題的有效途徑，具有良好的發(fā)展前景。當(dāng)前，以木質(zhì)纖維素為原料生產(chǎn)乙醇的工藝主要包括底物處理、水解和發(fā)酵三個環(huán)節(jié)，但由于發(fā)酵過程中產(chǎn)生的底物抑制效應(yīng)，顯著降低了纖維素酶發(fā)酵能力和水平。在前期研究中本課題組從南極土壤中篩選了一株產(chǎn)低溫纖維素酶菌株SC-5，該菌株具有最適生長溫度與釀酒酵母相接近的特性，產(chǎn)生的低溫纖維素酶能夠解決纖維素酶水解最佳溫度和酵母最佳發(fā)酵、生長溫度不一致及底物抑制等問題。基于此開展同步發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的小試研究，最終建立起木質(zhì)纖維素同步糖化發(fā)酵技術(shù)體系[1-4]。

甜高粱作為能源作物，莖稈含糖量高，在國內(nèi)外被廣泛用作生產(chǎn)燃料乙醇的原料[5-7]，利用甜高粱生產(chǎn)無水乙醇產(chǎn)量得率較高[8]。山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所培育的甜高粱新品種“濟甜雜2號”具有生物學(xué)產(chǎn)量高、莖稈多汁、含糖錘度高等特點，是生產(chǎn)生物乙醇的良好底物，且其耐鹽抗逆性強，是黃河三角洲鹽堿地經(jīng)濟作物種植的良好選擇。本研究擬以“濟甜雜2號”為原料，利用SC-5菌株進(jìn)行同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)纖維素乙醇。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

發(fā)酵菌株SC-5由本實驗室保存。發(fā)酵底物“濟甜雜2號”甜高粱稈取自山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所試驗田。釀酒酵母為安琪酵母股份有限公司生產(chǎn)的釀酒活性干酵母。常規(guī)化學(xué)試劑均為國藥集團生產(chǎn)。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同pH值、溫度對SC-5纖維素酶的影響 在配置不同pH緩沖液的基礎(chǔ)上測定濾紙酶活，pH值分別設(shè)為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，篩選出最適pH值。在最適pH緩沖液中加入酶液，設(shè)置不同溫度梯度（25、33、35、38、40、43、46、50、55℃）進(jìn)行酶活測定，以最高酶活值為參照分別作圖。

1.2.2 SC-5纖維素酶熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性測定 分別將酶液保存在不同溫度（23、30、35、42℃）下，間隔30 min測定酶活；分別將酶液調(diào)置成不同pH值（pH值設(shè)為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0），1 h后回調(diào)為最適pH值測定酶活，以初始酶活為參照作圖。

1.2.3 乙醇對SC-5纖維素酶活性的影響 在不同乙醇濃度下（5%、10%、15%、20%、25%），測定SC-5纖維素酶酶活，以零添加乙醇為參照作圖。

1.2.4 發(fā)酵底物甜高粱稈預(yù)處理 將1.0 kg冷凍甜高粱稈解凍，切成長度2～4 cm小段，用粉碎機粉碎；按照1∶15（g：mL）的固液比，將粉碎的高粱稈與1.5%（W/W）的H2SO4混勻分別裝入容器內(nèi)，裝料系數(shù)大約為80%，高溫處理0.5 h（121℃），用10 mol/L NaOH將其pH調(diào)至5.2；將瓶中酸化處理后的高粱稈經(jīng)過濾后，烘干渣滓備用。

1.2.5 活性干酵母活化 稱取10 g干酵母放置于1 000 mL三角瓶中，加入無菌葡萄糖（2%）溶液1 000 mL，充分?jǐn)嚢杌靹颍?0℃活化1.5 h。

1.2.6 制備發(fā)酵酶液和發(fā)酵培養(yǎng)基 將SC-5發(fā)酵液進(jìn)行離心，取上清即發(fā)酵酶液，并進(jìn)行酶活力檢測。按照成分配比[酵母粉6%，蛋白胨10%，尿素0.4%，（NH4）2HPO4 0.2%]制備20倍發(fā)酵培養(yǎng)基，121℃滅菌20 min。

1.2.7 底物發(fā)酵 采用同步糖化發(fā)酵：按照15 PFU/g甜高粱稈加入適量體積的SC-5發(fā)酵上清液。加入相應(yīng)發(fā)酵上清液20倍體積的發(fā)酵培養(yǎng)基。按照15%的比例接種酵母，36℃、100 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。

1.2.8 測定發(fā)酵乙醇濃度 乙醇濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：分別取0.9%、0.7%、0.5%、0.3%、0.1%的乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液2.0 mL分別放入樣品瓶，95℃加熱5～10 min，完全蒸發(fā)掉乙醇后，取樣1.0 mL氣相色譜測試，制作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。將同步糖化發(fā)酵液離心15 min（5 000 r/min），上清液經(jīng)濾膜抽濾。然后將待測液放入樣品瓶，95℃加熱5～10 min，完全蒸發(fā)掉乙醇后，取樣1.0 mL氣相色譜測試，對比標(biāo)準(zhǔn)曲線算得乙醇濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 SC-5纖維素酶反應(yīng)條件及酶活分析

2.1.1 不同pH值、溫度對SC-5纖維素酶的影響 如圖1所示， SC-5纖維素酶活性在pH值為6.0時最高，同步糖化發(fā)酵底物纖維素處理采用稀硫酸法處理，因此發(fā)酵pH環(huán)境與SC-5纖維素酶同步發(fā)酵最佳pH值相一致。

如圖2所示，SC-5纖維素酶在35～50℃條件下酶活較高，最適溫度為40℃，該溫度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他纖維素酶最適溫度（50℃），屬于低溫纖維素酶的范圍。

2.1.2 SC-5纖維素酶熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性測定 如圖3所示，35℃處理1 h，酶活力保持85%左右，SC-5纖維素酶屬于熱穩(wěn)定較好菌株，對后續(xù)同步糖化發(fā)酵具有良好的溫度選擇性。

如圖4所示，在pH值6.0環(huán)境下保持1 h，酶活能夠保持85%，pH值為4.0～8.0時，酶活力保持在60%左右，表明SC-5纖維素酶具有較廣的pH適應(yīng)范圍。

2.1.3 乙醇對SC-5纖維素酶活性影響 如圖5所示，SC-5纖維素酶能夠耐受較高的乙醇濃度，在乙醇濃度升至20%時，酶活還能夠達(dá)到40%，乙醇濃度在15%時，酶活能夠保持在60%，表明SC-5纖維素酶對發(fā)酵底物乙醇的耐受性較高，有利于同步糖化發(fā)酵反應(yīng)。

2.2 同步糖化發(fā)酵

在發(fā)酵溫度36℃、pH值6.0條件下，對甜高粱稈進(jìn)行同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)纖維素乙醇，根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖6）得到發(fā)酵液所含乙醇濃度，經(jīng)乙醇密度表計算得出1.0 kg甜高粱稈經(jīng)SC-5產(chǎn)低溫纖維素酶發(fā)酵可生產(chǎn)45 g乙醇。

3 討論與結(jié)論

3.1 發(fā)酵溫度對同步糖化發(fā)酵周期長短和乙醇得率影響較大，是影響發(fā)酵水平的關(guān)鍵因素。目前，同步糖化發(fā)酵纖維素反應(yīng)通常采用的纖維素酶最適溫度在50℃以上，而酵母最適溫度在30℃左右，兩者在溫度適應(yīng)方面存在著顯著差異，嚴(yán)重影響同步糖化發(fā)酵反應(yīng)效率。通過上述研究表明，SC-5纖維素酶最適溫度為40℃，該溫度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他纖維素酶最適溫度，與釀酒酵母的最適生長溫度較為接近。將發(fā)酵溫度設(shè)置為36℃，最大程度兼顧了SC-5纖維素酶活和釀酒酵母生長。SC-5纖維素酶最適pH值為6.0，與釀酒酵母最適生長pH值（pH值4.5～5.0）較為接近，也有利于同步糖化發(fā)酵反應(yīng)。

3.2 通過開展SC-5纖維素酶熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性及乙醇耐受性試驗，表明在pH值6.0時，SC-5纖維素酶活性能夠保持在85%左右，pH值為4.0～8.0時，酶活保持在60%左右，表明SC-5纖維素酶pH適應(yīng)性較廣；35℃處理1 h，酶活力保持85%左右，表明SC-5纖維素酶熱穩(wěn)定較好。乙醇濃度在15%時，酶活能夠保持60%左右，表明乙醇SC-5纖維素酶對乙醇的耐受性較高。

3.3 在底物處理過程，利用稀硫酸處理甜高粱稈是為了破壞木質(zhì)素的晶體結(jié)構(gòu)，促進(jìn)酸催化水解過程的發(fā)生。由于木質(zhì)素能夠絡(luò)合纖維素酶，將增加纖維素酶的用量，導(dǎo)致成本增加，因此木質(zhì)素預(yù)處理程度是提升纖維素酶酶解效率的重要因素。底物酸化是發(fā)酵的重要環(huán)節(jié)，調(diào)定酸化處理甜高粱稈處理液pH值時，對高溫處理后的固液物充分?jǐn)嚢杌靹?，保持發(fā)酵環(huán)境穩(wěn)定的pH值是提高發(fā)酵產(chǎn)率的必要條件。

3.4 同步發(fā)酵過程中，為提高SC-5發(fā)酵液的酶活力，加入適量20倍的發(fā)酵培養(yǎng)基，再以15%比例加入活化的酵母，保持溫度在36℃，保證了發(fā)酵液酶活力，實現(xiàn)了酵母最適發(fā)酵溫度下的同步發(fā)酵。經(jīng)充分振蕩培養(yǎng)，增加了發(fā)酵液溶氧比例，形成了酵母耗氧繁殖和無氧發(fā)酵環(huán)境，提高了乙醇發(fā)酵產(chǎn)率。

3.5 試驗結(jié)果顯示，在發(fā)酵溫度36℃、pH值6.0條件下，1.0 kg甜高粱稈共生產(chǎn)出約45 g乙醇，說明菌株SC-5產(chǎn)生的低溫纖維素酶具有較強的活性，能夠與釀酒酵母在相同的溫度、環(huán)境條件下實現(xiàn)同步發(fā)酵，且產(chǎn)物得率較好。本研究建立的木質(zhì)纖維素同步糖化發(fā)酵技術(shù)體系，簡化了生產(chǎn)過程和環(huán)節(jié)，節(jié)約了生產(chǎn)成本，提高了乙醇生產(chǎn)效率。

3.6 在后續(xù)工作中將進(jìn)一步優(yōu)化甜高粱稈的前處理方式，減小原料顆粒直徑，提高水解效率。通過誘變等方式進(jìn)一步改良菌株特性，提高纖維素酶活力，建立更加優(yōu)化的同步發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)體系；在生產(chǎn)纖維素乙醇的同時，能夠生產(chǎn)高附加值的木糖及肥力高的有機肥等副產(chǎn)品，增加附加經(jīng)濟效益，提升該產(chǎn)業(yè)鏈價值，不斷加快該技術(shù)在生產(chǎn)中的推廣應(yīng)用。

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