王艷華，覃娜，魯仕琦

三峽大學醫(yī)學院 病理學系，湖北 宜昌 443002

骨肉瘤是20歲以下青少年最常見的惡性實體腫瘤，起源于骨間質組織，具有高度惡性、強力侵犯和早期肺轉移的特點[1-2]。骨肉瘤的臨床治療遠不理想，雖然隨著三聯(lián)抗癌治療策略的快速發(fā)展，患者的總生存率提高了20% ～30% ，但截肢術后5年存活率僅5% ～15%(3)。因此，尋找更有效的治療策略是當前骨肉瘤防治研究的重點。納米粒子是指有一維尺寸處于1～100 nm量級的小粒子，借助其納米尺寸效應，它們可通過高通透性的腫瘤血管，富集于腫瘤內，即具有高通透性和滯留效應（enhanced permeability and retention effect，EPR效應），抑制其生長和發(fā)展[4-5]。除了自身具有抗腫瘤作用外，一些納米粒子還可作為抗腫瘤藥物載體，加載多種抗腫瘤藥物，靶向投遞于腫瘤組織內，協(xié)同增強抗腫瘤效應[6-10]。本文綜述近年來與骨肉瘤治療密切相關的納米粒子的研究進展，以期為骨肉瘤的臨床治療提供參考。

1 無機納米粒子

1.1 羥基磷灰石基納米粒子

羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA），是人體骨和牙最主要的無機晶體[11]。納米羥基磷灰石不僅具有良好的骨誘導性能，還具有強的抗腫瘤特性。當前圍繞HA納米粒子的研究也取得了一些進展，尤其是作為納米藥物載體應用于骨肉瘤的治療研究之中。Wu等制備了載2種藥物（二磷酸鹽和溴結構域蛋白抑制劑）的HA納米粒子，利用K7M2骨肉瘤細胞模型評估了它們的抗癌性能，發(fā)現(xiàn)2種抗癌藥物均使HA結晶性能降低，尤其是具有高親和性的二磷酸鹽；載溴結構域蛋白抑制劑的HA納米粒子不僅能在骨肉瘤細胞內緩慢釋放藥物，還能抑制骨肉瘤細胞向成骨細胞分化，下調Ezrin的表達，上調RUNX2的表達[12]。Dhar?man等采用超聲波輻射的方法制備了不同濃度的鉍（Bi）和礦物（M）取代的HA納米粒子Bi-MHAP，觀察了它們對骨肉瘤細胞集落形成及體內腫瘤生長的影響。結果發(fā)現(xiàn)，該納米粒子不僅能促進成骨增殖、增強機械強度，還能抑制腫瘤細胞集落形成和腫瘤組織的生長[13]。Lin等利用簡便的共沉淀法制備了SF/n-HA復合材料，并將其沉積于鈦合金基片表面，定量分析了SF/n-HA納米復合材料對骨肉瘤MG63細胞成骨分化的影響。經掃描電子顯微鏡（SEM）和MTT測試發(fā)現(xiàn)，該納米復合物具有較好的生物活性，成骨細胞易于黏附生長。Western印跡表明該納米材料作用后的骨肉瘤細胞堿性磷酸酶（ALP）活力下降，骨鈣素（BGP）和Ⅰ型膠原（ColⅠ）表達量增高，說明SF/n-HA復合材料具有較好的細胞黏附和成骨分化潛能[14]。以上研究表明，以無機HA為基礎的納米藥物載體，可通過多種方式抑制骨肉瘤生長，有望應用于骨肉瘤的治療中。

1.2 金屬基納米粒子

近年來，金屬基納米粒子備受學者們青睞。如Ag、Ti、Zn、Ce、Au等金屬，由于各自獨特的本征特性，可通過多種方式制備成納米顆粒，用于骨肉瘤的治療。Nayak等介紹了一種利用樹皮（來自孟加拉榕和印度苦楝樹樹種）提取物制備銀納米粒子的綠色合成方法，并評估了它們的抗微生物活性和對抗骨肉瘤增殖效應。動態(tài)光散射（DLS）表征分析顯示，由孟加拉榕樹皮合成的納米粒子尺寸約85.95 nm，而由印度苦楝樹樹皮合成的納米粒子尺寸為90.13 nm。UV-Vis測試發(fā)現(xiàn)，2種樹皮提取物合成的納米粒子在426和420 nm波長處均具有吸收峰。經場發(fā)射掃描電鏡（FSEM）、X線衍射（XRD）、傅里葉變換紅外光譜（FTIR）、原子力顯微鏡（AFM）表征發(fā)現(xiàn)，所合成的納米粒子為60 nm的球形粒子，具有銀離子特有的衍射峰和功能基團。這些納米粒子能對抗革蘭陰性菌（如大腸桿菌、綠膿桿菌、霍亂弧菌）和陽性菌（如枯草芽孢桿菌）的生長，它們的最小抑菌濃度（MIC）分別為 12.5和 25 μg/mL。所合成的納米銀對骨肉瘤MG63細胞也顯示了劑量依賴式的抗增殖作用，其半數抑制量（IC50）分別為81.8±2.6（由印度苦楝樹樹皮制備）和75.5±2.4 μg/mL（由孟加拉榕樹樹皮制備）。以上結果提示，所合成的納米銀粒子可作為廣譜抗腫瘤和抗微生物治療劑使用[15]。Kovacs等利用P53基因在多種腫瘤中功能缺失這一特性，提出了基于激發(fā)P53功能的治療策略的巧妙思路，制備了銀納米粒子，檢測了它們對P53抑癌基因功能缺失的骨肉瘤細胞（U2OS、Saos-2）的胞毒效應。結果發(fā)現(xiàn)，用5和35 nm尺寸的檸檬酸包被的銀納米粒子處理后的骨肉瘤細胞線粒體結構和功能紊亂，細胞凋亡率增高，說明該納米粒子殺滅骨肉瘤細胞不依賴P53功能狀態(tài)，這一特征使得銀納米粒子成為化療策略極具魅力的候選[16]。Iram等報道了一種利用真菌（尖孢鐮刀菌）內部轉化合成氧化鋱（Tb2O3）納米粒子的綠色制備途徑。把Tb2O3納米粒子與骨肉瘤MG-63和Saos-2細胞共培養(yǎng)，其 IC50為 0.102 μg/mL，而當濃度范圍為 0.023～0.373 μg/mL時，骨肉瘤細胞活力呈濃度依賴式降低。形態(tài)學研究發(fā)現(xiàn)，納米粒子作用后的骨肉瘤細胞縮小、核固縮、凋亡小體形成。流式細胞術（FCM）測試和DAPI染色證實，腫瘤細胞呈劑量依賴式的凋亡[17]。Ai等報道了一種具有增強抗骨肉瘤效應的葉酸標記TiO2納米粒子，其尺寸隨聚合物的加入而增大，葉酸修飾能提高TiO2的抗骨肉瘤效應，源于葉酸能與腫瘤細胞表面高表達的葉酸受體特異性結合。尤其是FA-TiO2納米粒子能導致骨肉瘤細胞染色質濃縮、核固縮和質膜出泡，呈現(xiàn)近38% 的凋亡率，進一步檢測發(fā)現(xiàn)細胞周期停滯于G0期（G0細胞比例高達25% ），細胞凋亡相關蛋白如細胞色素C、caspase-3、聚ADP核糖聚合酶（PARP）的表達明顯增高[18]。Kang等構建了基于Au-Ag納米棒的近紅外光響應性的藥物載體系統(tǒng)，包被有DNA交聯(lián)的聚合物外殼，利用DNA的互補性原則可發(fā)展聚丙烯酰胺基溶膠凝膠轉化體系，以用于包裹抗癌藥物。這種Au-Ag近紅外基納米凝膠也能與它的靶向基團結合從而功能化，比如核酸適配體特異靶向對腫瘤細胞的識別。當暴露于近紅外光時，該納米棒的光熱效應十分明顯，從而可控釋放內部藥物。體外研究也顯示，核酸適配體功能化的納米凝膠可作為藥物載體，通過近紅外光的高空間和溫度分辨率效應，實現(xiàn)靶向藥物遞送的遠程可控性[19]。Sisub?alan等通過生物學路徑合成了ZnO和CeO2納米粒子，探索了其在生物醫(yī)學和藥學中的利用價值。研究發(fā)現(xiàn)，ZnO和CeO2納米粒子造成骨肉瘤細胞膜損傷，胞內出現(xiàn)氧化應激，使活性氧簇（ROS）升高，進而細胞凋亡[20]。以上研究說明，金屬基納米粒子可通過多種途徑合成，并經不同的作用方式抑制腫瘤細胞的生長。

2 有機納米粒子

2.1 PLGA或PEG高分子有機納米粒子

聚乳酸-羥基乙酸共聚物［poly（lactic-co-gly?colic acid），PLGA］和聚乙二醇（polyethylene gly?col，PEG）均是可生物降解的有機高分子[21-22]。利用PLGA或PEG可制備出多種形貌尺寸的微納米粒子，廣泛應用于生物醫(yī)學領域。Altindal等通過乳劑-擴散-蒸發(fā)法制備了褪黑素加載的PLGA納米粒子和微米粒子，粒徑分別約為200和3.5 nm。研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素加載的納米粒子包封率為14% ，在生理緩沖液中緩慢釋放褪黑素，到40 d結束時其釋放量近70% 。骨肉瘤MG63細胞實驗表明，當與載有1.7 μg褪黑素的0.05 mg納米粒子共培養(yǎng)時，細胞生長被抑制，說明褪黑素加載的PLGA納米粒子具有胞毒作用，可用于骨肉瘤的化療[23]。Ray等制備了甲氨蝶呤（MTX）加載的PLGA納米粒子（MTX-PLGA），評價了該納米粒子的藥物代謝動力學、組織分布、動物存活率及抗癌效應。結果表明，該納米粒子對BALB/c裸鼠的半數致死量（LD50）和抗癌功效均高于純的MTX化療，提示該納米粒子的生物安全性好、抗骨肉瘤性能強[24]。Guan等通過離子交聯(lián)方式制備了100 nm的mPEG-CS納米粒子，并以1∶3的比例將該納米粒子懸液與短發(fā)夾RNA（shRNA）溶液混合，轉染骨肉瘤MG63細胞，MTT、RT-PCR和Western印跡檢測，發(fā)現(xiàn)mPEG-CS納米粒子能下調凋亡抑制蛋白livin和survivin的表達，抑制細胞增殖，促進細胞凋亡[25]。以上研究說明，基于PLGA或PEG的高分子有機納米粒子也可用于骨肉瘤的治療。

2.2 脂質基納米粒子

脂質基納米粒子在骨肉瘤治療中的研究較多。Yolanda等通過熱乳劑技術將阿霉素（doxoru?bicin，DOX）和依地福新（edelfosine）包被于脂質納米粒子中，觀察了它們對耐藥骨肉瘤細胞生長的協(xié)同抵抗作用，發(fā)現(xiàn)它們能逆轉由P-糖蛋白（P-gp）表達上調所致的骨肉瘤細胞耐藥，且兩藥具有協(xié)同效應[26]。Duan等制備了球形的聚合物脂質雜化納米粒子（PE-LPN），能加載化療藥物紫杉醇（PTX）和依托泊苷（ETP），可被腫瘤細胞內吞，且兩藥聯(lián)合的胞毒作用比單藥更強，骨肉瘤細胞Ki-67陽性表達率降低（＜25% ）[27]。Yu等發(fā)展了表皮生長因子受體（EGFR）交聯(lián)的鹽霉素（salinomycin）加載的聚合物脂質雜化納米粒子（EGFR-SNPs），研究了它們靶向腫瘤干細胞（CSCs）和腫瘤細胞的潛能。該納米粒子尺寸約95 nm，對鹽霉素的藥物包封率為63% ，并可持續(xù)緩釋120 h；該納米粒子還能靶向2種腫瘤細胞，產生胞毒作用，減少CD34+CSCs的比例，抑制癌巢形成[28]。Fateme等制備了脂質化阿霉素（LDOX），通過分析骨肉瘤細胞攝取和細胞活力變化來優(yōu)化DOX的用藥劑量。結果發(fā)現(xiàn)，直徑為96 nm的L-DOX呈圓球形，對DOX的包封率高達84% ，并能穩(wěn)定釋放14 d，與細胞共培養(yǎng)時能提高細胞通透性，促進細胞死亡[29]。因此，脂質基納米粒子也具有較好的抗骨肉瘤效應。

2.3 殼聚糖基納米粒子

殼聚糖又名甲殼素，具有抗菌抗癌等多種生物效應[30-32]。圍繞殼聚糖納米粒子的研究也取得了一定的進展。Tian等利用兩親性嵌段共聚物作為藥物載體，制備了粉防己堿加載的CS-PAA納米粒子。該納米粒子呈球形，表面帶正電荷，能抑制骨肉瘤MG63細胞增殖，促進細胞凋亡。Western印跡證實，抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL表達下調，而促凋亡蛋白Bax表達上調[33]。Li等探索了泊洛沙姆（poloxamer）修飾的三甲基殼聚糖（TMC）包被甲氨蝶呤用于治療骨肉瘤的可能性。結果發(fā)現(xiàn)，甲氨蝶呤加載的聚醚殼聚糖納米粒子（MTCN）能作為納米載體，控制藥物釋放。該納米粒子可被骨肉瘤MG63攝取，在胞漿內富集產生胞毒作用，促進細胞凋亡（凋亡率高達48% ）。該研究提示，TMC可作為納米藥物載體用于骨肉瘤的化療[34]。

2.4 肽基納米粒子和納米凝膠

肽基納米粒子和納米凝膠是近年發(fā)展起來的納米材料，對骨肉瘤具有高度選擇性，而對正常細胞低毒。Chang等以兩親性肽C18GR7RGDS作為姜黃素的載體，制備了肽-姜黃素納米粒子，該納米粒子可包封姜黃素于它的疏水核心，提高姜黃素的水溶性，細胞實驗表明該納米粒子可選擇性抑制骨肉瘤MG-63細胞的生長[35]。Li等制備了肽修飾的聚合納米凝膠，用以加載紫草素（shi?konin），實現(xiàn)靶向骨肉瘤細胞的跨膜投遞，細胞和動物實驗表明它能促進骨肉瘤細胞凋亡，并遏制骨肉瘤肺轉移[36]。以上研究說明，肽基納米粒子和納米凝膠均是較好的藥物載體，可實現(xiàn)抗骨肉瘤藥物的靶向投遞。

3 基于納米脈沖刺激的治療策略

納秒脈沖電場（nanosecond pulsed electric field，nsPEF）即納米脈沖刺激（nano-pulse stimula?tion，NPS），具有刺激針對腫瘤細胞的免疫反應的潛能。Chen等研究了NPS對晚期肺轉移腫瘤模型動物的局部和全身反應。他們選擇了12只自發(fā)骨肉瘤的犬和12只荷肝癌的裸鼠，用40 kv/cm強度、1 Hz 500脈沖的電極刺激動物腫瘤組織，觀察動物的生存時間、腫瘤尺寸、血清ALP水平、關節(jié)囊損傷和肺轉移情況。結果表明，NPS無熱損傷和關節(jié)畸變效應，能遏制腫瘤生長和轉移，延長動物生存時間[37]。因此，局部應用NPS是一種無熱治療策略，能減緩骨肉瘤原發(fā)病灶的生長，延長生存期。

4 結語

骨肉瘤是青少年最常見的惡性骨腫瘤，高發(fā)于四肢長骨干骺端，臨床上易早期復發(fā)、血行肺轉移。其治療一般采用大劑量化療和手術的綜合治療策略，由于診斷技術或手術后預防措施不完善，最終導致治療不徹底或腫瘤復發(fā)。納米粒子鑒于其自身結構和功能的特殊性，可作為納米藥物載體，推動骨肉瘤治療研究的進步?；诩{米粒子的骨肉瘤臨床治療前景可望，尤其是作為抗骨肉瘤納米藥物載體的應用。然而當前人們對上述納米粒子與骨肉瘤相互作用的理論認知和實踐應用還存在諸多困難，使其臨床應用受到了極大限制，如不同形貌、尺寸的納米粒子對骨肉瘤的生長是否存在形貌、尺寸依賴的抗癌效應？不同基質納米粒子抵抗骨肉瘤生長的分子機制是否相同？不同種系骨肉瘤細胞對同一納米粒子的刺激反應是否存在差異？相信隨著對納米粒子結構-性能關系規(guī)律研究的深入，以及它們抗骨肉瘤作用分子機理的闡釋，將為納米粒子應用于骨肉瘤的精準治療帶來一線希望。