王江，徐華，謝劍煒

軍事醫(yī)學(xué)研究院 毒物藥物研究所，北京 100850

肉毒神經(jīng)毒素（botulinum neurotoxin，BoNT）主要由肉毒梭狀芽孢桿菌產(chǎn)生，是已知對(duì)人類毒性最強(qiáng)的天然蛋白質(zhì)毒素，能夠引起人和動(dòng)物中毒乃至死亡，對(duì)人的半數(shù)致死量（LD50）為0.1～1 ng/kg。天然發(fā)生的食源性肉毒中毒主要是由于罐頭等食品加工生產(chǎn)不當(dāng)引起的，吸毒者創(chuàng)傷性肉毒中毒也處于上升趨勢(shì)。同時(shí)，A型肉毒毒素（BoNT/A）和B型肉毒毒素（BoNT/B）已經(jīng)商業(yè)化發(fā)展成為各種局部肌張力障礙、自主神經(jīng)功能障礙和醫(yī)療美容等的治療藥物[1]，治療過程中時(shí)有中毒事件發(fā)生，對(duì)其注射液的安全性評(píng)價(jià)顯得尤為重要。此外，因其高毒性和易于生產(chǎn)，肉毒毒素成為潛在的生物武器和生物恐怖襲擊戰(zhàn)劑[2]。因此，建立對(duì)肉毒毒素快速且靈敏的確證檢測(cè)方法具有極其重要的醫(yī)學(xué)和軍事意義。

1 肉毒毒素結(jié)構(gòu)與分類

根據(jù)其抗原屬性（產(chǎn)生毒素的抗原性），可將BoNT分為7個(gè)血清型，即A～G型。人類肉毒中毒主要由A、B、E型引起，偶爾由F型BoNT引起，C型和D型主要引起禽畜和動(dòng)物中毒。BoNT可經(jīng)黏膜表層吸收[3]。7種血清型中，A型毒性最強(qiáng)，其次是B、E、F型。

BoNT從肉毒桿菌中以復(fù)合物的形式釋放，包含各種非毒性的保護(hù)毒素，以免受水解蛋白和胃腸道酸性環(huán)境降解[4]。BoNT的相對(duì)分子質(zhì)量（Mr）約為150×103，由4個(gè)結(jié)構(gòu)域組成三維空間結(jié)構(gòu)，BoNT/A是最早確定晶體結(jié)構(gòu)的血清型全毒素[5]。肉毒毒素在內(nèi)源或外源性的蛋白水解酶作用下被切割為重鏈（HC，Mr約為100×103）和輕鏈（LC，Mr約為 50×103）而顯示其毒性[6]。重鏈便于毒素通過內(nèi)吞作用進(jìn)入神經(jīng)元細(xì)胞，輕鏈作為鋅依賴的金屬蛋白酶，普遍被認(rèn)為是肉毒毒素的毒性部分。輕鏈能夠特異性地酶切可溶性亞酰胺敏感因子吸附蛋白受體（SNAREs），SNARE蛋白家族是神經(jīng)遞質(zhì)釋放所必需的蛋白，能夠催化膜融合，主要包括位于轉(zhuǎn)運(yùn)小泡膜上的VAMP［也稱作突觸小泡蛋白（synaptobrevin）］、位于突觸前膜上的SNAP-25和突觸融合蛋白（syntaxin），以及一些胞質(zhì)蛋白。一個(gè)SNARE蛋白的裂解能阻斷神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和相關(guān)神經(jīng)肌肉接頭的失活，最終導(dǎo)致肌肉麻痹[7]。肉毒毒素對(duì)其底物具有高度選擇性[8]，A和E型特異性酶切SNAP-25蛋白，B、D、F和G型特異性酶切VAMP蛋白，C型的酶切底物則為突觸融合蛋白和SNAP-25蛋白[9]。盡管肉毒毒素各結(jié)構(gòu)域的作用已知，由離子鍵緊密連接的重鏈和輕鏈分開的機(jī)制仍不清楚[10]。

2 肉毒毒素檢測(cè)方法

2.1 小鼠生物試驗(yàn)法（mouse bioassay，MBA）

小鼠生物試驗(yàn)法是公認(rèn)的肉毒毒素檢測(cè)“金標(biāo)準(zhǔn)”，能評(píng)估活性毒素的整體功能（例如結(jié)合、轉(zhuǎn)位和水解功能），檢測(cè)肉毒毒素的7種血清型。該實(shí)驗(yàn)以小鼠半數(shù)致死量（mouse median lethal dose，MLD50）為基礎(chǔ)，給多組小鼠腹腔注射系列濃度梯度的毒素樣本，以確定當(dāng)半數(shù)小鼠死亡時(shí)的毒素濃度。對(duì)于檢測(cè)BoNT/A，MBA的靈敏度可達(dá)10 pg/mL，此濃度與1 MLD50/mL一致[11]。盡管該檢測(cè)方法靈敏度高，但是存在一定的局限性：每種血清型毒素的檢測(cè)都需要1 mL體積的樣品，最理想的狀態(tài)是＞4 mL的樣品量，當(dāng)樣品采自嬰兒糞樣或食物殘留物時(shí)，難以滿足檢測(cè)需求；此外，盡管該方法能在24 h內(nèi)得出陽性結(jié)果，但是需要4～5 d確證陰性樣品或低濃度樣品[12]；樣品中存在其他細(xì)菌或微生物時(shí)，也會(huì)對(duì)試驗(yàn)造成干擾。由于MBA法用于肉毒毒素檢測(cè)存在其局限性，以及提倡減少活體動(dòng)物的使用，許多體外檢測(cè)方法迅速發(fā)展起來。

2.2 免疫學(xué)檢測(cè)方法

2.2.1 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA） 在過去30年中，ELISA成為最廣泛應(yīng)用于肉毒毒素血清型鑒定和檢測(cè)的技術(shù)，該方法以抗原抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)，夾心免疫分析法是最常見的形式，使用2種毒素特異性的抗體，其中一種作為捕獲抗體，另一種作為檢測(cè)抗體?？谷舛径舅氐牟东@抗體與待測(cè)樣品結(jié)合，加入酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體，顯色后在酶標(biāo)儀中檢測(cè)比色或發(fā)光信號(hào)，產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度通常與樣品中毒素的量成比例[13]。對(duì)ELISA法進(jìn)行改進(jìn)能提高其檢測(cè)肉毒毒素的靈敏度，例如采用噬菌體肽庫篩選技術(shù)篩選出的環(huán)肽作為捕獲抗體，抗BoNT/A多克隆抗體作為檢測(cè)抗體，采用化學(xué)發(fā)光ELISA法，檢測(cè)靈敏度可達(dá)1 pg/mL。近年來，夾心免疫分析法使用高親和力單克隆抗體檢測(cè)BoNT/A和BoNT/B，檢測(cè)限低于小鼠生物試驗(yàn)法（10 pg/mL）[14]。但是ELISA方法也存在其缺點(diǎn)，例如不能確定毒素是否仍具有功能活性，檢測(cè)復(fù)雜臨床樣品時(shí)靈敏度較低，容易發(fā)生交叉反應(yīng)導(dǎo)致假陽性結(jié)果等。

2.2.2 免疫色譜法（immunochromatography assays，ICA） 側(cè)向?qū)游龊椭鶎游鍪敲庖呱V法中的2種方法，二者在檢測(cè)速度和便于現(xiàn)場(chǎng)使用方面具有很大的優(yōu)勢(shì)。側(cè)向?qū)游鍪且环N便攜式的在硝酸纖維條上反應(yīng)的試紙，將捕獲抗體滴于硝酸纖維支架上，其他的反應(yīng)試劑（例如檢測(cè)抗體、緩沖液、控制抗體）干結(jié)到反應(yīng)板上。待測(cè)樣品滴到反應(yīng)板（樣品帶）上發(fā)生水合作用，毒素與檢測(cè)抗體結(jié)合后從樣品帶遷移到檢測(cè)帶被捕獲抗體捕捉。該捕獲步驟使毒素濃縮并與標(biāo)記后的二抗結(jié)合形成復(fù)合物，產(chǎn)生明顯的有色條帶。常見的標(biāo)記如膠體金，能與毒素樣品產(chǎn)生紅色條帶，或是不同顏色的與檢測(cè)抗體結(jié)合的乳球[15]。

側(cè)向?qū)游龇治鏊俣瓤烨页杀镜?，是理想的肉毒毒素快速確證方法，但其應(yīng)用仍然存在一定的局限性。首先，側(cè)向?qū)游龅撵`敏度為10～20 ng/mL（具體取決于毒素類型）[16]，與其他快速檢測(cè)方法相比仍較低；其次，側(cè)向?qū)游鰞H能提供肉眼可見的定性結(jié)果，無法對(duì)毒素進(jìn)行定量。隨著更高親和力的抗體和更好的檢測(cè)標(biāo)記物的可實(shí)現(xiàn)，側(cè)向?qū)游龅撵`敏度有望提高。近年的研究表明，采用單一的側(cè)向?qū)游鲈嚰埬軌蛲瑫r(shí)辨別和確證BoNT/A、BoNT/B，表明側(cè)向?qū)游鲈嚰堄型蔀槭称钒踩I(lǐng)域強(qiáng)有力的分析工具[17]。

2.2.3 免疫PCR法（immuno-PCR） 免疫PCR法與ELISA相似，被分析物的檢測(cè)是以抗原-抗體復(fù)合物的形式為基礎(chǔ)，結(jié)合抗體的特異性與報(bào)告DNA分子通過PCR擴(kuò)增，發(fā)展出檢測(cè)BoNT較為靈敏的方法。該法使用的檢測(cè)抗體是與報(bào)告DNA分子結(jié)合的抗體，而不是一種酶。DNA分子與毒素特異性檢測(cè)抗體結(jié)合后通過傳統(tǒng)PCR或?qū)崟r(shí)PCR很容易實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，免疫PCR檢測(cè)BoNT/A檢測(cè)限可達(dá)5 pg（50 μL體系中），采用相同抗體檢測(cè)時(shí)，免疫PCR法的靈敏度可比ELISA提高1000倍[18]。Chao[19]等采用生物素化的報(bào)告DNA分子通過鏈霉親和素與生物素化的抗體結(jié)合，并優(yōu)化報(bào)告DNA分子與鏈霉親和素的量以降低背景干擾，檢測(cè)BoNT/A的靈敏度可達(dá)50 fg（50 μL體系中）。

2.3 基于生物傳感器的檢測(cè)方法（biosensor based assays）

與毒素檢測(cè)相關(guān)的一些特定傳感器技術(shù)有陣列生物傳感器法（array biosensor assay）、芯片ELISA法（ELISA-on-a-chip，EOC）和適配體電化學(xué)方法（aptamer-electrochemical assay）。對(duì)于肉毒毒素的快速檢測(cè)，生物傳感器技術(shù)已經(jīng)發(fā)展了以表面等離子共振、折射、熒光和化學(xué)發(fā)光為基礎(chǔ)的技術(shù)，這些技術(shù)通常取決于毒素-蛋白（通常是一種抗體）的結(jié)合，結(jié)合的結(jié)果能直接測(cè)量[2]。Han[20]等發(fā)展了結(jié)合ELISA和免疫色譜技術(shù)的EOC法用于現(xiàn)場(chǎng)偵檢，產(chǎn)生的比色發(fā)光信號(hào)能被基于電感偶合的檢測(cè)器檢測(cè)，定量檢測(cè)BoNT/A的靈敏度為2 ng/mL。然而，生物傳感器技術(shù)與ELISA方法相比通常缺乏足夠的靈敏度、特異性和重復(fù)性。

2.4 熒光共振能量轉(zhuǎn)移法（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）

熒光共振能量轉(zhuǎn)移是依賴于供體和受體分子間距離的光物理進(jìn)程，處于激發(fā)態(tài)的熒光團(tuán)通過偶極子間的相互作用，將能量以非輻射的方式轉(zhuǎn)移給鄰近的受體分子，從而導(dǎo)致供體熒光淬滅和受體熒光發(fā)射的增加[21]。FRET已發(fā)展成為A、B、E、F型肉毒毒素高通量檢測(cè)的方法，各血清型毒素作用于其特異性底物導(dǎo)致底物熒光性發(fā)生變化而被檢測(cè)。該方法通常使用一條兩端有標(biāo)記的寡肽模仿天然底物，一個(gè)熒光受體分子連接在一側(cè)末端，一個(gè)熒光供體連接在另一末端，熒光共振能量從供體轉(zhuǎn)移到受體僅發(fā)生于底物肽未斷裂、兩端標(biāo)記都完整并彼此極為鄰近時(shí)。當(dāng)毒素作用時(shí)底物肽斷裂，兩側(cè)標(biāo)記被分隔開，因此阻斷了熒光能量的轉(zhuǎn)移，F(xiàn)RET現(xiàn)象也隨之消失。熒光共振能量的減少直接與肉毒毒素濃度成比例[2]。與ELISA相比，F(xiàn)RET的最大優(yōu)點(diǎn)是能夠檢測(cè)活性毒素。Joshi[22]比較了FRET的2種底物SSA[23]和SNAPtide在檢測(cè)BoNT/A時(shí)的靈敏度，發(fā)現(xiàn)采用SSA檢測(cè)的靈敏度比SNAPtide（150 ng/mL）提高一個(gè)數(shù)量級(jí)，檢測(cè)血漿樣本中BoNT/A檢測(cè)限為15 ng/mL；此外，采用SSA為底物可篩選BoNT/A輕鏈的突變株，因此可用于區(qū)分生物學(xué)功能和非生物學(xué)功能的BoNT/A輕鏈。

2.5 細(xì)胞學(xué)檢測(cè)法（cell-based assays）

細(xì)胞學(xué)檢測(cè)法是模擬活體中毒的體外檢測(cè)方法，它能在體外較好地模擬活體中毒。該方法有望成為小鼠生物試驗(yàn)法的替代方法，并且是近年來的研究熱點(diǎn)[24]。細(xì)胞試驗(yàn)法常用的細(xì)胞有傳代細(xì)胞系如neuro-2a、PC12和SK-N-SH細(xì)胞，或者使用來源于雞、小鼠的原代神經(jīng)元細(xì)胞和小鼠、大鼠脊髓細(xì)胞[25]。細(xì)胞內(nèi)肉毒毒素活性的檢測(cè)可通過蛋白質(zhì)印跡分析法檢測(cè)靶蛋白的裂解產(chǎn)物，另外可通過特異性熒光共振能量轉(zhuǎn)移法檢測(cè)或神經(jīng)元活性測(cè)定。采用傳代細(xì)胞系的檢測(cè)方法在臨床樣本肉毒毒素活性測(cè)定中靈敏度相對(duì)不足，但采用制備的原代神經(jīng)元細(xì)胞檢測(cè)，其靈敏度與小鼠生物試驗(yàn)法（10 pg/mL）近似[26]。細(xì)胞試驗(yàn)法也存在一些缺點(diǎn)，如耗時(shí)長(zhǎng)、試驗(yàn)流程復(fù)雜、需要組織或細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備。

2.6 肽鏈內(nèi)切酶質(zhì)譜法（Endopep-MS assay）

肽鏈內(nèi)切酶質(zhì)譜法是一種快速且靈敏的檢測(cè)方法，不僅能測(cè)定毒素的活性，還可以確定肉毒毒素的血清型[27]。該方法以毒素的蛋白水解酶活性為基礎(chǔ)，不同的肉毒毒素血清型在其特異的位點(diǎn)酶切特定的底物肽段，例如BoNT/A在SNAP-25蛋白的Q197和R198兩個(gè)氨基酸殘基之間進(jìn)行酶切[28]。通過質(zhì)譜檢測(cè)質(zhì)量特異的酶切產(chǎn)物可以確定肉毒毒素血清型，克服了傳統(tǒng)ELISA檢測(cè)方法中不同血清型具有交叉反應(yīng)的缺點(diǎn)。底物肽段可模仿肉毒毒素在體內(nèi)的靶標(biāo)SNAP-25或突觸小泡蛋白2的氨基酸序列組成[27]。一般采用基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-MS）或電噴霧離子源質(zhì)譜（ESI-MS）進(jìn)行檢測(cè)。肽鏈內(nèi)切酶質(zhì)譜法能在不同的樣本基質(zhì)中檢測(cè)肉毒毒素，檢測(cè)限低于小鼠生物試驗(yàn)法。就A、B、E、F型肉毒毒素而言，內(nèi)切酶質(zhì)譜法對(duì)于血清樣本的檢測(cè)限為0.05～0.5 MLD50/mL。

內(nèi)切酶質(zhì)譜法主要通過優(yōu)化底物肽段和優(yōu)化臨床樣品前處理提高檢測(cè)靈敏度，特定的底物肽段對(duì)肉毒毒素的親和力以及肉毒毒素對(duì)底物肽段的酶切效率直接影響產(chǎn)物肽段的量，進(jìn)而影響檢測(cè)靈敏度。目前，大多數(shù)研究采用MALDIMS檢測(cè)，Barr等[29]選取BoNT/A原始底物SNAP-25的185～206位氨基酸殘基組成的肽段進(jìn)行修飾，通過底物肽末端修飾，內(nèi)部氨基酸替代[30]，肽段長(zhǎng)度適當(dāng)延伸和酶切位點(diǎn)附近氨基酸替換[31]等策略提高BoNT/A檢測(cè)靈敏度。值得注意的是，一些臨床樣本如糞樣中存在的高濃度非特異內(nèi)源性蛋白或蛋白酶，會(huì)導(dǎo)致干擾背景并降低內(nèi)切酶質(zhì)譜法檢測(cè)的靈敏度，因此需要采取一些前處理降低樣品中雜質(zhì)蛋白的干擾。例如采用高親和力抗體偶聯(lián)免疫磁珠捕獲毒素[32]，采用高濃度鈉鹽洗滌磁珠-毒素復(fù)合物并加入蛋白酶抑制劑，能夠有效減少樣品中的蛋白酶[33]。通過一系列優(yōu)化，MALDI-MS檢測(cè)BoNT/A的靈敏度可達(dá)0.1 MLD50/mL（血漿）和0.2 MLD50/mL（糞樣）。目前采用ESI-MS檢測(cè)BoNT的文獻(xiàn)并不多，但ESI-MS在定量準(zhǔn)確性及數(shù)據(jù)重現(xiàn)性等方面有極大的優(yōu)勢(shì)，檢測(cè)BoNT靈敏度高且特異性強(qiáng)，僅需數(shù)小時(shí)即可完成。該方法亦可通過優(yōu)化底物肽段等策略提高檢測(cè)靈敏度，例如Rosen等[34]采用優(yōu)化的底物肽189RTRIDEGNQRATR（Nle）LG204檢測(cè)血漿樣品中的BoNT/A，靈敏度可達(dá)0.1 MLD50/mL。此外，ESI-MS還可在毒素-底物酶切反應(yīng)體系中同時(shí)檢測(cè)不同血清型的BoNT，減少所需樣品體積并節(jié)約檢測(cè)時(shí)間，Rosen等[34]將 BoNT/A、BoNT/B、BoNT/E 3種毒素特異的底物肽混合，單次反應(yīng)即可同時(shí)檢測(cè)血漿樣品中的3種毒素，BoNT/B、BoNT/E的檢測(cè)靈敏度與BoNT/A相當(dāng)。

作為有力的毒素分析確證技術(shù)，內(nèi)切酶質(zhì)譜法已成為近年來肉毒毒素檢測(cè)的研究熱點(diǎn)，但其需要昂貴的質(zhì)譜儀、繁瑣的樣品前處理和專業(yè)的數(shù)據(jù)分析，在大規(guī)模臨床樣品中的應(yīng)用有待進(jìn)一步驗(yàn)證。隨著質(zhì)譜儀小型化和各種新型離子源質(zhì)譜的快速發(fā)展，內(nèi)切酶質(zhì)譜法有望成為廣泛應(yīng)用的肉毒毒素檢測(cè)方法。

3 展望

肉毒毒素是一種高毒性和最具威脅的生物恐怖戰(zhàn)劑，在臨床應(yīng)用和可疑的肉毒毒素食物中毒檢測(cè)中，需要靈敏度高和血清型特異性的檢測(cè)方法。小鼠生物試驗(yàn)法是肉毒毒素檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但耗時(shí)長(zhǎng)、非自動(dòng)化操作、需要使用動(dòng)物等使其應(yīng)用受到限制。目前，肉毒毒素體外檢測(cè)方法取得了顯著進(jìn)步，例如改進(jìn)后的ELISA法和FRET法能夠檢測(cè)活性和非活性的神經(jīng)毒素，在肉毒毒素功能研究中已有很大進(jìn)展，一些細(xì)胞學(xué)檢測(cè)法相比于小鼠生物試驗(yàn)法，檢測(cè)靈敏度更高。肽鏈內(nèi)切酶質(zhì)譜法由于具有較高的靈敏度、血清型特異性和能夠檢測(cè)毒素活性，得到越來越廣泛的應(yīng)用，其檢測(cè)方法的成功建立對(duì)同類神經(jīng)毒素的檢測(cè)具有極大的借鑒意義，例如內(nèi)切酶質(zhì)譜法可拓展應(yīng)用于其他蛋白水解酶毒素（如破傷風(fēng)毒素）的檢測(cè)。當(dāng)然，本文所提及的方法都需要進(jìn)一步優(yōu)化，以及應(yīng)用于食品樣品、臨床樣品和環(huán)境樣品的深入驗(yàn)證。質(zhì)譜技術(shù)的快速發(fā)展，尤其是ESI-MS的強(qiáng)大分析能力，結(jié)合新型的生物傳感器和多樣化的技術(shù)，有望發(fā)展出更加理想的肉毒毒素檢測(cè)方法。