林貝 李健秀 劉雪凌

（燕京理工學(xué)院，廊坊 065201）

隨著環(huán)境污染的日益加劇和化石能源的日益枯竭，可再生清潔能源生物乙醇的開(kāi)發(fā)和利用受到了廣泛關(guān)注。木質(zhì)纖維素是世界上最豐富的生物物質(zhì)資源，利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)燃料乙醇具有重大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)意義［1］。預(yù)處理是利用木質(zhì)纖維素類(lèi)生物質(zhì)的首要環(huán)節(jié)，迄今為止國(guó)內(nèi)外研究開(kāi)發(fā)了包括物理法、化學(xué)法、生物法等在內(nèi)的多種預(yù)處理技術(shù)［2］。在預(yù)處理過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生一些毒副產(chǎn)物（抑制劑），影響到微生物的正常生長(zhǎng)和隨后的發(fā)酵過(guò)程［3］。雖然預(yù)處理的方法不同，產(chǎn)生的抑制劑種類(lèi)和含量也有一些變化，但是主要為呋喃醛類(lèi)化合物、酚類(lèi)化合物和弱酸3大類(lèi)［4］。以下綜述了各類(lèi)抑制劑的形成及其作用機(jī)制，并討論了對(duì)于抑制劑的應(yīng)對(duì)措施，旨為該領(lǐng)域研究人員提供方法的參考。

1 抑制劑的形成及其作用機(jī)制

1.1 呋喃醛類(lèi)化合物

呋喃醛類(lèi)化合物主要包括糠醛和羥甲基糠醛（HMF），分別由戊糖和己糖脫水形成［4-5］，其中，糠醛的毒性大于HMF，兩者具有相似的抑制作用和作用機(jī)制，抑制菌體生長(zhǎng)，使延滯期增長(zhǎng)，降低乙醇得率和產(chǎn)量，其中對(duì)菌體生長(zhǎng)的抑制作用要強(qiáng)于對(duì)乙醇生成的抑制作用［6］。本文作者通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，糠醛在0.5-1.5 g/L范圍內(nèi)對(duì)菌體生長(zhǎng)有抑制作用，但使乙醇得率提高［7］。此外，糠醛和HMF對(duì)微生物的抑制還存在著協(xié)同效應(yīng)，兩者共同存在時(shí)對(duì)微生物發(fā)酵的抑制效果更加明顯［8］。

呋喃醛類(lèi)化合物可能的抑制機(jī)制有：（1）以糠醛和HMF為代表的呋喃醛類(lèi)化合物會(huì)直接抑制微生物代謝過(guò)程中一些關(guān)鍵酶（如乙醇脫氫酶、丙酮酸脫氫酶和醛脫氫酶等）的生物學(xué)活性［9-10］，從而影響微生物對(duì)糖的代謝及乙醇的生成過(guò)程。（2）兩者都可被酵母的醛還原酶轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的毒性較低的醇，轉(zhuǎn)化過(guò)程需要消耗ATP和NAD（P）H?？啡┑霓D(zhuǎn)化需要輔酶NADH，NADH的減少以及糠醛對(duì)乙醇脫氫酶的直接抑制造成了乙醛在胞內(nèi)積累，從而使菌體生長(zhǎng)受到抑制，乙醇生成延遲［6］。HMF的轉(zhuǎn)化偏好NADPH，而氨基酸與核酸的合成需要NADPH，HMF的轉(zhuǎn)化與生物物質(zhì)的合成和細(xì)胞生長(zhǎng)相競(jìng)爭(zhēng)。因此，糠醛和HMF存在，會(huì)與微生物代謝過(guò)程中的酶爭(zhēng)奪NAD（P）H，使得代謝活動(dòng)被抑制或延遲。（3）糠醛和HMF會(huì)降解DNA，阻礙mRNA的翻譯和蛋白質(zhì)合成的過(guò)程，Iwaki［11］等研究證實(shí)糠醛和HMF會(huì)誘導(dǎo)信使RNP顆粒的形成和衰減釀酒酵母內(nèi)的翻譯活動(dòng)，使得酵母細(xì)胞生理狀態(tài)退化。（4）近些年來(lái)的研究證實(shí)糠醛還會(huì)誘導(dǎo)釀酒酵母中活性氧（ROS）的積累，引起細(xì)胞損傷，細(xì)胞暴露在高濃度糠醛下，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜破壞，核染色質(zhì)和肌動(dòng)蛋白破壞，甚至死亡［12］。Allen等［12］通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)酵母在糠醛濃度25 mmol/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，經(jīng)過(guò)一段延滯期之后可恢復(fù)生長(zhǎng)，而當(dāng)糠醛濃度50 mmol/L時(shí)則嚴(yán)重抑制了菌體的生長(zhǎng)。在一定濃度范圍內(nèi)，酵母可通過(guò)將抑制因子轉(zhuǎn)化為低毒的醇而具有一定的耐受性，轉(zhuǎn)化即在生長(zhǎng)延滯期進(jìn)行，這時(shí)乙醇的產(chǎn)生以及相應(yīng)的酶都被抑制，當(dāng)抑制因子減少，生長(zhǎng)便會(huì)重新開(kāi)始，前提是細(xì)胞必須能夠在毒性作用下幸存并修復(fù)產(chǎn)生的損傷。與50 mmol/L糠醛相比，25 mmol/L糠醛引起的細(xì)胞損傷減少，因此酵母在延滯期后能恢復(fù)生長(zhǎng)。

1.2 弱酸

木質(zhì)纖維素水解液中的弱酸包括乙酸、甲酸和乙酰丙酸。乙酸是由兩種方式形成的：在預(yù)處理的過(guò)程中，半纖維素在高溫水解等作用下脫乙酰基生成［2］；發(fā)酵過(guò)程中形成的副產(chǎn)物。甲酸由糠醛和HMF分解形成；乙酰丙酸由HMF分解形成［4-5］。

弱酸造成了胞內(nèi)環(huán)境的酸化，必須通過(guò)消耗ATP 將多余的質(zhì)子泵出以維持胞內(nèi)的中性環(huán)境，影響了細(xì)胞正常的能量供給［13］。在一定濃度范圍內(nèi)，弱酸對(duì)乙醇生成有促進(jìn)作用，所消耗的糖更多的轉(zhuǎn)化為乙醇，而在高于這一濃度時(shí)，乙醇得率則會(huì)降低［14-15］。這一現(xiàn)象可能是由于在弱酸存在下，需要額外的ATP產(chǎn)生，于是以減少生物量的生成為代價(jià)，強(qiáng)迫細(xì)胞通過(guò)代謝糖生成酒精來(lái)產(chǎn)生ATP。酒精生成受兩方面的影響，生物量及ATP高需求的影響，弱酸濃度較低時(shí)，以ATP高需求因素為主，因此對(duì)酒精生成有促進(jìn)作用，所消耗的糖更多的轉(zhuǎn)化為酒精，而菌體生長(zhǎng)受到一定的抑制，胞內(nèi)陰離子的積聚及與酸的直接接觸也都有可能影響到菌的生長(zhǎng)，當(dāng)弱酸濃度增高時(shí)，則導(dǎo)致細(xì)胞膜破壞，細(xì)胞活性下降甚至死亡［16］。作者通過(guò)研究甲酸、乙酸對(duì)酵母發(fā)酵的影響，證實(shí)甲酸和乙酸對(duì)菌體生長(zhǎng)的抑制強(qiáng)于對(duì)乙醇生成的抑制，且甲酸的抑制程度遠(yuǎn)大于乙酸［7］。此外，有研究表明，當(dāng)pH5-6的發(fā)酵液中乙酸濃度達(dá)到7.5 g/L（125 mmol/L），菌體生長(zhǎng)就被明顯抑制，且發(fā)酵環(huán)境的pH值對(duì)甲酸和乙酸的抑制作用有重要影響，較高的pH環(huán)境有利于減弱其抑制作用［17］。

1.3 酚類(lèi)化合物

酚類(lèi)化合物主要由木質(zhì)素在高溫酸解等預(yù)處理過(guò)程中分解產(chǎn)生［2，4-5］，可分為3大類(lèi)：以4-羥基苯甲醛等為代表的p-羥苯基化合物；以丁香醛等為代表的丁香族化合物；以愈創(chuàng)木酚、香草醛等為代表的愈創(chuàng)木酚族化合物［18］。關(guān)于酚類(lèi)化合物的研究相對(duì)較少，其抑制機(jī)理到目前還不是很清楚，通常認(rèn)為其毒性較大，可以造成細(xì)胞膜部分或整體的破壞，從而影響細(xì)胞生長(zhǎng)和糖的利用［4］。另有研究表明，高濃度的香草醛會(huì)抑制翻譯過(guò)程，影響蛋白質(zhì)的合成［18］。

Yi等［19］分別選取4-羥基苯甲醛、丁香醛、香草醛作為p-羥苯基化合物、丁香族化合物、愈創(chuàng)木酚族化合物的代表，研究3種化合物對(duì)Zymomonas mobilisZM4生長(zhǎng)及發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響，結(jié)果表明，在分別添加5 mmol/L的4-羥基苯甲醛、丁香醛、香草醛的情況下，最大細(xì)胞密度依次降低了5倍、1.4倍和3.1倍，葡萄糖消耗和酒精生成分別延遲了12、16、24 h，酒精體積生產(chǎn)率由0.73分別降至0.24、0.70和0.61 g/L/h。以上3種化合物中，分子量最低的4-羥基苯甲醛的毒性最大；并體現(xiàn)了取代基位置對(duì)抑制作用的影響；實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)3種化合物都可以被Zymomonas mobilisZM4降解為相應(yīng)的醇。這些結(jié)論與先前對(duì)于酵母的研究具有類(lèi)似性［4］，可為酚類(lèi)化合物抑制機(jī)理的深入研究提供依據(jù)。

這些抑制劑的存在對(duì)乙醇發(fā)酵的影響，已成為木質(zhì)纖維素乙醇生物加工過(guò)程的主要瓶頸之一。為減少抑制劑影響，可采取以下幾種策略：（1）防止在預(yù)處理中形成抑制劑；（2）發(fā)酵前進(jìn)行脫毒；（3）篩選耐受性微生物或?qū)ξ⑸镞M(jìn)行耐受性改造等。

2 預(yù)處理方式及脫毒措施減少抑制劑濃度

近些年來(lái)，圍繞著減少抑制劑的產(chǎn)生，發(fā)展了多種預(yù)處理方法。研究發(fā)現(xiàn)，溫和的熱水預(yù)處理（未添加酸催化劑）［20］、瞬間彈射蒸汽爆破（ICSE）技術(shù)［21］、60Coγ輻照的方法［22］，均在不同程度上降低了某些抑制劑的濃度。此外，研究人員通過(guò)在預(yù)處理過(guò)程中加入催化劑，或?qū)蓚€(gè)或多個(gè)預(yù)處理技術(shù)結(jié)合使用有效減少了抑制劑的產(chǎn)生。Jacquet等［23］在水稻、甘蔗渣和芒草的蒸汽預(yù)處理過(guò)程中使用二氧化碳或二氧化硫等催化劑，有效降低了抑制劑的濃度。Zhu等［24］研究了用微波與NaOH和H2SO4協(xié)同處理芒草，與單一的預(yù)處理方法相比，不但使抑制劑濃度降低，還使糖的濃度升高，大大縮短了預(yù)處理的時(shí)間。

采用不同的預(yù)處理工藝可在源頭上控制抑制劑的產(chǎn)生。但是，選用預(yù)處理方法時(shí)不僅要考慮產(chǎn)生的抑制劑濃度，更重要的是要綜合考慮高纖維素和隨后的高糖產(chǎn)量等預(yù)處理效果，以及技術(shù)、經(jīng)濟(jì)等因素，以滿(mǎn)足工業(yè)需求。因此，實(shí)際選取的最適預(yù)處理方法有時(shí)無(wú)法滿(mǎn)足低抑制劑濃度的要求。在積極探索降低抑制劑濃度的預(yù)處理方法的同時(shí)，發(fā)展合適的脫毒方法，是減少發(fā)酵抑制物的又一有效措施。

近幾十年來(lái)，人們嘗試了多種方法對(duì)木質(zhì)纖維素水解液進(jìn)行發(fā)酵前的脫毒處理，包括生物方法、物理方法、化學(xué)方法以及多種方法聯(lián)用，脫毒方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，且不同的方法對(duì)各種不同抑制物的去除效果也有較大差異［25-26］。利用微生物脫毒的效果顯著，Cao等［27］使用C. ligniariaNRRL30616 對(duì)玉米秸稈水解液進(jìn)行脫毒處理，去除了＞95%的乙酸和＞50%的糠醛、HMF以及酚類(lèi)化合物。煤油霉菌Amorphotheca resinaeZN1［28］是目前比較理想的用于脫毒的微生物，能夠快速降解乙酸、糠醛、HMF，且脫毒過(guò)程不使用任何耗水和耗能的操作［29］，具有工業(yè)實(shí)用價(jià)值。脫毒雖然是減少抑制物的有效的方法，但是多數(shù)脫毒過(guò)程會(huì)造成糖的損失和生產(chǎn)成本的增加。目前，隨著大量的微生物被發(fā)現(xiàn)具有“脫毒”的功能，人們將研究的重點(diǎn)放在了菌株上，選育那些能夠?qū)σ种莆镌幻摱镜母吣褪苄跃?，?duì)生物質(zhì)乙醇轉(zhuǎn)化工業(yè)的發(fā)展有著很重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3 耐受抑制劑的菌株的選育

近些年來(lái)，針對(duì)耐受性微生物，尤其是對(duì)酵母菌在抑制劑存在下的響應(yīng)及分子水平上的適應(yīng)性進(jìn)行了大量研究，已經(jīng)獲得了酵母細(xì)胞對(duì)抑制物響應(yīng)的許多基礎(chǔ)信息［30］，這些為耐受性菌株的改造提供了依據(jù)。目前，人們已通過(guò)篩選、誘變、馴化、代謝工程改造等方法以及這些方法的聯(lián)合應(yīng)用，獲得了一些較為理想的用于木質(zhì)纖維素乙醇轉(zhuǎn)化的菌種。

3.1 通過(guò)篩選、誘變獲得耐性菌株

從自然界中直接分離耐抑制劑菌株是一種經(jīng)濟(jì)實(shí)用的方法。在自然界的長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，有些菌株體現(xiàn)出了在耐抑制劑能力方面的特性和穩(wěn)定性。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，S. cerevisiaeATCC 4124、S.cerevisiaeTMB3000、S. cerevisiaeKF-7等均表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抑制物耐受性［31-32，15］。Mattam 等［33］從土壤中篩選出菌株Candida tropicalisMTCC 25057，不但有較強(qiáng)的抑制物耐受性，還具有在32-42℃產(chǎn)纖維素酶和木聚糖酶的能力，可用于糖化-發(fā)酵聯(lián)合生物工藝（CBP）［34-35］中。此外，用木質(zhì)纖維素水解液或是混合抑制物模擬水解液從自然界尤其是富含木質(zhì)纖維素原料的地點(diǎn)有目的的進(jìn)行篩選是一種更加快速、有效的方式［36］。

誘變篩選是微生物菌種改良常用的技術(shù)，一般可采取紫外線（UV）、X射線等物理誘變方法或利用烷化劑甲基磺酸乙酯（EMS）等化學(xué)誘變方法。研究表明，通過(guò)紫外線誘變得到的突變株，對(duì)抑制物的耐受性提高，發(fā)酵性能提高［37-39］。Srisuda等［40］對(duì)Scheffersomyces shehatae進(jìn)行紫外照射，采用TTC方法初篩后，依次用杜漢發(fā)酵管、限氧條件培養(yǎng)篩選出突變株TTC79，對(duì)抑制劑的耐受性提高，且與野生菌株相比，木糖代謝增多，乙醇的生成增多，在對(duì)甘蔗渣水解液的發(fā)酵中，乙醇的得率、體積生產(chǎn)率及理論收率分別為0.46 g/g、0.20 g/L/h和90.61%，高于野生型的對(duì)應(yīng)值0.20 g/g、0.04 g/L/h和39.20%。此外，研究證明誘變往往會(huì)帶來(lái)菌株多種性能的提高或改變，不僅會(huì)提高其對(duì)抑制物的耐受性，而且有很大的概率會(huì)提高其對(duì)高糖、酒精以及高溫的耐受性能。Kumari等［41］通過(guò)甲基磺酸乙酯、n-甲基-n-硝基-n-亞硝基胍、近和遠(yuǎn)紫外線照射依次連續(xù)對(duì)葡萄糖-木糖共發(fā)酵的混合酵母菌RPR39進(jìn)行誘變，獲得的突變體RPRT90不但對(duì)糠醛、乙酸等抑制劑的耐受性提高，對(duì)乙醇、高溫等脅迫的耐受性也顯著提高，發(fā)酵生成的乙醇量相對(duì)原始菌株明顯提高?？梢?jiàn)，誘變是改造菌種的有效方式，可通過(guò)不斷的摸索嘗試，開(kāi)發(fā)新方法，得到優(yōu)良的耐受抑制劑的菌株。

自然篩選和誘變篩選具有一定的隨機(jī)性，但是方法簡(jiǎn)單易行，得到的這些菌株除了可以直接用于發(fā)酵外，也可作為菌種馴化或代謝工程技術(shù)改造的出發(fā)菌株。

3.2 通過(guò)進(jìn)化工程馴化提高菌株的耐受性

進(jìn)化工程馴化是讓細(xì)胞長(zhǎng)期處于某一環(huán)境中，提高菌株對(duì)環(huán)境的適應(yīng)力。在抑制劑存在的條件下，不斷進(jìn)行細(xì)胞傳代篩選可逐漸富集并得到對(duì)抑制劑耐受性增強(qiáng)的菌株。目前，馴化手段已經(jīng)成功的用于提高酵母對(duì)抑制物環(huán)境的耐受性。最初的研究集中在提高菌株對(duì)某種抑制劑的耐受性，近年來(lái)更多使用復(fù)合抑制劑環(huán)境或水解液環(huán)境對(duì)菌株進(jìn)行長(zhǎng)期馴化，使其能夠在多種抑制物存在下生長(zhǎng)和發(fā)酵產(chǎn)乙醇。Pereira等［42］在連續(xù)反應(yīng)器中流加未脫毒的硬木亞硫酸鹽水解液，使其濃度逐漸升高20%-60%（V/V）馴化Scheffersomyces stipitis，經(jīng)過(guò)382代后，在含有60%未脫毒水解液的固體培養(yǎng)基上篩選出最先生長(zhǎng)的10個(gè)菌株，為了保證它們的穩(wěn)定性，用非選擇性平板培養(yǎng)基連續(xù)轉(zhuǎn)接十次，之后在含有60%未脫毒水解液的液體培養(yǎng)基中測(cè)試其發(fā)酵性能，從中篩選出優(yōu)勢(shì)菌株。Koppram等［43］用在12種抑制劑存在的情況下在搖瓶中進(jìn)行重復(fù)批次培養(yǎng)，以及在云杉水解液中進(jìn)行恒化培養(yǎng)兩種方式馴化經(jīng)過(guò)紫外誘變處理后的重組木糖代謝菌株Saccharomyces cerevisiaeTMB3400，分別馴化了429代和97代，得到相應(yīng)的菌株RK60-5、RKU90-3和KE1-17，它們?cè)谒庖褐械纳L(zhǎng)及乙醇生成比原菌株均有顯著提高。值得一提的是，重復(fù)批次馴化得到的菌株（RK60-5和RKU90-3）在厭氧條件下無(wú)法代謝木糖，而在恒化器中馴化的菌株KE1-17具有與原菌株TMB3400相似的木糖代謝速率，且對(duì)糠醛和HMF的轉(zhuǎn)化速率分別增加了3.5倍和4倍?？梢?jiàn)經(jīng)不同形式的馴化后，菌株的發(fā)酵性能顯示出較大的差異。初期的馴化研究主要是采用搖瓶的形式，其為進(jìn)一步的馴化研究奠定了基礎(chǔ)，但是由于搖瓶發(fā)酵的氧氣、pH等條件不確定，因此，穩(wěn)定的連續(xù)培養(yǎng)馴化是更為有效的形式。

在馴化過(guò)程中，微生物通過(guò)基因水平上的隨機(jī)突變的積累不斷適應(yīng)環(huán)境的變化，其機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。Almario等［44］用玉米秸稈稀酸水解液馴化Saccharomyces cerevisiae，研究發(fā)現(xiàn)，有些馴化后的突變體反而對(duì)單個(gè)抑制劑的耐受性減弱，盡管它們對(duì)于組合抑制劑的耐受性是增強(qiáng)的?？梢?jiàn)馴化過(guò)程中菌株對(duì)抑制劑適應(yīng)性變化的復(fù)雜性。

近幾年來(lái)，通過(guò)實(shí)時(shí)追蹤進(jìn)化過(guò)程（VERT）、利用代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、單基因敲除和微陣列分析等技術(shù)研究馴化后的菌株耐受抑制劑的分子機(jī)制，取得了一些研究成果，不但可用來(lái)解釋菌株的耐受機(jī)制，同時(shí)也為代謝工程改造菌株提供了依據(jù)和目標(biāo)［42-46］。

3.3 通過(guò)代謝工程手段提高菌株耐受性

代謝工程作為菌體改造的手段，相比篩選、馴化等菌株改良方式，具有更加集中的定向性和針對(duì)性。目前，關(guān)于釀酒酵母對(duì)于單個(gè)抑制劑的響應(yīng)研究已經(jīng)比較成熟，在此研究的基礎(chǔ)上，通過(guò)在酵母內(nèi)超表達(dá)相應(yīng)的基因，已經(jīng)定向設(shè)計(jì)出了一些針對(duì)某種抑制劑的高耐受性菌株［47］。

近幾年來(lái)，逐步開(kāi)展了耐受菌株對(duì)于多抑制劑共存時(shí)的響應(yīng)研究，Wang等［45］研究了耐受菌株對(duì)乙酸、糠醛、苯酚混合抑制物的響應(yīng)，通過(guò)代謝組學(xué)分析及單基因敲除，表明馴化后的耐受性菌株的代謝活動(dòng)增強(qiáng)，并確定了在多抑制劑耐受中起關(guān)鍵作用的基因。Thompson等［46］通過(guò)比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)得出了在13種抑制劑同時(shí)存在下的52種可能與脅迫相應(yīng)的基因，并通過(guò)熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在抑制劑的脅迫作用下，原始菌株的線粒體形態(tài)發(fā)生破壞，而馴化后的菌株基本沒(méi)有被破壞，且呈現(xiàn)了線粒體基因的高表達(dá)，作者提出，線粒體及其相關(guān)基因?qū)昕挂种苿┠芰ζ鹬匾淖饔茫铱尚迯?fù)抑制劑引起的損傷，是將來(lái)的重點(diǎn)研究方向。Pereira等［48］考查了釀酒酵母在麥秸水解液中對(duì)抑制劑的應(yīng)答，通過(guò)全基因組掃描，確定了200余種相關(guān)基因，且它們同時(shí)在維生素代謝、線粒體活動(dòng)等生物學(xué)功能中起作用。這些研究成果均為代謝工程改造菌種提供了依據(jù)和作用靶標(biāo)，同時(shí)，從以上研究中能夠看出通過(guò)代謝工程改造菌株使其耐受多種抑制劑的復(fù)雜性。因此，有學(xué)者認(rèn)為針對(duì)抑制劑的代謝工程改造在工業(yè)上并不實(shí)用，因?yàn)橐种苿┓N類(lèi)、濃度范圍很寬，不可能確定所有抑制劑轉(zhuǎn)化和耐受的相關(guān)基因以及它們之間復(fù)雜的關(guān)系［49］。

此外，有報(bào)道提出通過(guò)代謝工程改造釀酒酵母，使其能夠在脅迫下產(chǎn)生亞精胺，從而增強(qiáng)對(duì)乙酸和呋喃類(lèi)化合物的耐受性［50］。由于有機(jī)酸對(duì)細(xì)胞膜組成和功能的影響，通過(guò)調(diào)控一個(gè)或多個(gè)與細(xì)胞膜生成有關(guān)的基因，可減輕其毒害作用［50］。針對(duì)高濃度抑制物對(duì)翻譯過(guò)程的抑制，Ishida等［18］用ALD7作為啟動(dòng)子有效促進(jìn)了ALD6的表達(dá)，研究表明以ALD7作為啟動(dòng)子可克服由香草醛、糠醛、HMF引起的mRNA翻譯的抑制，同時(shí)也為培育優(yōu)良的菌種提供了一種新的基因工程方法。通過(guò)多種代謝工程手段提高菌株對(duì)抑制物的耐受性具有很大的發(fā)展?jié)摿?，是近些年?lái)的研究熱點(diǎn)。

篩選、誘變、馴化、代謝工程改造等方法各有其優(yōu)勢(shì)。目前，開(kāi)始聯(lián)合使用幾種方法來(lái)提高菌株的抑制劑耐受性。如進(jìn)化工程馴化與基因組重排相結(jié)合，篩選、γ射線輻射誘變與馴化聯(lián)用均有效提高了Saccharomyces cerevisiae的抑制劑耐受性［49，51］。本實(shí)驗(yàn)室采用紫外誘變、馴化相結(jié)合的方法對(duì)工業(yè)釀酒酵母Sc4126［52］進(jìn)行改造，篩選獲得一株對(duì)復(fù)合抑制劑（2 g/L糠醛、5 g/L乙酸、1 g/L香草醛）耐受性有所提高的菌株Sc4126-1。

4 總結(jié)

利用木質(zhì)纖維素類(lèi)生物質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)乙醇具有深遠(yuǎn)的意義，預(yù)處理產(chǎn)生的抑制劑是限制其發(fā)展的因素之一。在木質(zhì)纖維素乙醇生物加工過(guò)程中，要針對(duì)不同的體系并綜合考慮后續(xù)的纖維素酶處理和發(fā)酵過(guò)程，探索最適的預(yù)處理方式、脫毒方法，以及菌株的改良方法等。此外，發(fā)酵過(guò)程中的控制也可以有效減少抑制物的毒害作用，如Zhu等［53］將SSCF過(guò)程應(yīng)用于高固體物料量的發(fā)酵過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，使用該策略可有效避免抑制劑對(duì)發(fā)酵菌株的毒害作用，郝學(xué)密等［54］在發(fā)酵過(guò)程中采用氧化還原電位（Oxidation potential，ORP）調(diào)控，提高了釀酒酵母細(xì)胞對(duì)抑制劑的耐受性。

在這些應(yīng)對(duì)措施中，對(duì)微生物進(jìn)行代謝工程改造目前被認(rèn)為是克服抑制劑對(duì)乙醇發(fā)酵影響的最有前途的方法［55-56］。隨著基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等系統(tǒng)生物學(xué)方法的應(yīng)用，微生物耐受抑制劑的分子機(jī)制逐漸被揭示，并確定了若干與抑制劑耐受相關(guān)的基因［45-48］，利用合成生物學(xué)方法［57-58］人工設(shè)計(jì)和構(gòu)建耐受微生物是未來(lái)的研究方向。解決抑制劑對(duì)于乙醇發(fā)酵的影響這一主要技術(shù)瓶頸，木質(zhì)纖維素大規(guī)模生產(chǎn)乙醇定會(huì)取得較大進(jìn)展。

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