李沛翰 李鵬 宋宏彬

（解放軍疾病預(yù)防控制所，北京 100071）

近年來(lái)，嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒（Sever acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV）、中東呼吸綜合征冠狀病毒（Middle East respiratory syndrome-related coronavirus，MERS-CoV）、埃博拉病毒（Ebola virus）、甲型流感病毒H7N9亞型（Influenza A virus subtype H7N9）等新發(fā)突發(fā)病原體造成的傳染病疫情給公共衛(wèi)生防控帶來(lái)嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。2002年國(guó)內(nèi)暴發(fā)了嚴(yán)重急性呼吸道感染疫情，初期病原體難以確定給疫情防控帶來(lái)極大困難。直至2003年4月，研究人員明確病原為SARS冠狀病毒，并制定針對(duì)性的診斷方法和預(yù)防措施，疫情才得到有效控制。此次疫情先后蔓延至37個(gè)國(guó)家，共導(dǎo)致約8 000人感染和774例死亡，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失和社會(huì)恐慌［1-2］。因此在應(yīng)對(duì)公共衛(wèi)生突發(fā)事件，尤其是新發(fā)突發(fā)傳染病時(shí)，快速準(zhǔn)確識(shí)別致病病原對(duì)制定疫情防控策略至關(guān)重要。

傳統(tǒng)病原檢測(cè)以分離培養(yǎng)、顯微鏡觀察、血清學(xué)診斷及PCR等方法為主，存在諸多問(wèn)題。分離培養(yǎng)方法適用于少數(shù)可培養(yǎng)微生物，但目前僅不足1%的細(xì)菌可以通過(guò)這種方式進(jìn)行鑒定［3］；顯微鏡觀察從形態(tài)學(xué)上進(jìn)行鑒定，但靈敏度較低［4］；血清學(xué)診斷容易出現(xiàn)交叉反應(yīng)，特異性差［5］；PCR方法無(wú)法檢測(cè)未知病原和變異較大病原［6］?；趥鹘y(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，目前高達(dá)40%的腸胃炎和60%的腦炎臨床病例無(wú)法有效確定致病病原［7-8］。

20世紀(jì)90年代，Handelsman等［9］首次提出了宏基因組（Metagenome）的概念，其泛指環(huán)境樣本中所有微生物基因組的總和。隨后宏基因組學(xué)（Metagenomics）被定義為將現(xiàn)代基因組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于直接研究自然狀態(tài)下的微生物群落，避免在實(shí)驗(yàn)室單獨(dú)分離微生物的科學(xué)［10］。宏基因組學(xué)研究廣泛應(yīng)用于土壤、水體等環(huán)境樣本，以及與人類疾病相關(guān)的微生物群落的生物多樣性分析。此外，由于宏基因組學(xué)無(wú)需單獨(dú)對(duì)病原分離培養(yǎng)，通過(guò)核酸提取純化可以直接分析臨床樣本，其為傳染病病原尤其是未知病原檢測(cè)提供了新的技術(shù)手段和思路［11］。

本文對(duì)宏基因組學(xué)的技術(shù)進(jìn)展及其在病原監(jiān)測(cè)、檢測(cè)和溯源等公共衛(wèi)生領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行了綜述，旨在為傳染病預(yù)防和控制提供參考和新視角。

1 宏基因組技術(shù)進(jìn)展

宏基因組學(xué)以樣本中所有核酸為研究對(duì)象，隨著各類技術(shù)的不斷發(fā)展，宏基因組學(xué)逐步走向成熟，并且在核酸提取、高通量測(cè)序和數(shù)據(jù)分析等方面均有較大發(fā)展空間。

1.1 核酸提取

臨床樣本包含多種微生物，且非核酸雜質(zhì)多，核酸提取的效率和純度相對(duì)較低，核酸提取是宏基因組研究的關(guān)鍵步驟。根據(jù)研究目的和樣本差異，選擇合適的提取方法得到高質(zhì)量核酸有利于后續(xù)病原的鑒定分析。

細(xì)菌結(jié)構(gòu)差異會(huì)給測(cè)序結(jié)果帶來(lái)較大影響。研究表明使用研磨珠裂解法比酶裂解法獲得更多雙歧桿菌核酸，并導(dǎo)致結(jié)果中梭菌屬和放線菌群組成差異［12］。20世紀(jì)90年代的幾項(xiàng)研究表明細(xì)菌的16S rDNA序列是病原體發(fā)現(xiàn)和鑒定的重要依據(jù)［13-14］，早期的宏基因組學(xué)以16S rDNA測(cè)序?yàn)橹?，常用?lái)分析樣本中菌群分布特征。16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序采用通用引物擴(kuò)增，引物選擇至關(guān)重要。Marchesi等［15］對(duì)兩種引物進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，63f-1387r引物能比27f-1392r擴(kuò)增得到更多的物種。通過(guò)測(cè)試175個(gè)引物和512個(gè)引物對(duì)，Klindworth等［16］發(fā)現(xiàn)僅有10個(gè)引物能擴(kuò)增較多種微生物，但這些引物對(duì)古細(xì)菌擴(kuò)增效果差，仍需進(jìn)行額外引物設(shè)計(jì)。高變區(qū)（V區(qū)）的選擇策略不同也會(huì)造成結(jié)果差異。Claesson等［17］發(fā)現(xiàn)V6區(qū)域可變性高，有利于分析物種多樣性，但V4區(qū)域比V6區(qū)域獲得更高準(zhǔn)確度。

相比原核和真核生物，病毒基因組較短，其在臨床感染樣本中豐度較低，且與多種其它類型生物核酸混雜，如何排除干擾提取濃度較高的病毒核酸對(duì)于宏基因組研究至關(guān)重要。Thurber等［18］提出了使用SYBR-Gold試劑染色，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)處理樣品中病毒顆粒的數(shù)量，濃縮來(lái)自各種類型樣品的病毒顆粒，消除污染細(xì)胞和游離核酸。此外，對(duì)于研究某一生態(tài)群落的病毒，可使用隨機(jī)PCR進(jìn)行擴(kuò)增，其關(guān)鍵點(diǎn)在于需要針對(duì)某一病毒群體如呼吸道病毒、腸道病毒等設(shè)計(jì)通用引物。對(duì)于DNA病毒核酸富集提取采用CTAB法、氯仿抽提法等，前者使用十六烷基三甲基溴化銨（Cetyl-trimethylammonium bromide，CTAB）溶液提取，并通過(guò)“三合一”溶液（酚:氯仿:異戊醇=25∶24∶1）等步驟實(shí)現(xiàn)病毒DNA的提純［19］；后者則采用十二烷基磺酸鈉（Sodium dodecyl sulfonate，SDS）和苯酚-氯仿萃取，最終實(shí)現(xiàn)樣本DNA病毒的提?。?0］。RNA病毒核酸提取常采用Trizol 法，該方法使用異硫氰酸胍、苯酚和氯仿形成三相溶液，進(jìn)一步通過(guò)分離中間相和有機(jī)相中的DNA和蛋白質(zhì)，然后可沉淀得到水相中的病毒RNA［21］。此外，大量商業(yè)化試劑盒和自動(dòng)化制備儀器的出現(xiàn)，使病毒核酸提取更加方便快捷，如專門純化提取RNA病毒的試劑盒QIAamp Viral RNA Mini Kit，以及自動(dòng)化核酸提取工作站Qiagen BioRobot 9604 等［22］。

1.2 高通量測(cè)序

受限于測(cè)序技術(shù)，16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序早期使用Sanger法，隨后出現(xiàn)基于焦磷酸測(cè)序方法的商業(yè)化測(cè)序平臺(tái)454，其通量比傳統(tǒng)Sanger法高，在16S rDNA高變區(qū)測(cè)序和病原鑒定中具有廣泛的應(yīng)用［23］。

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，Illumina與Ion Torrent測(cè)序平臺(tái)作為第二代測(cè)序平臺(tái)主導(dǎo)，與454相比其成本大幅下降，在宏基因組測(cè)序中展示出巨大潛力。研究顯示Ion Torrent PGM測(cè)序速度比Illumina MiSeq更高，且能比MiSeq獲得更高的讀長(zhǎng)，但是MiSeq的覆蓋度較高［24］。

二代測(cè)序需要對(duì)樣本進(jìn)行建庫(kù)及擴(kuò)增，初始樣本中的物種豐度差異導(dǎo)致擴(kuò)增后出現(xiàn)高豐度物種覆蓋過(guò)高和低豐度物種覆蓋不足的情況。臨床樣本包含多種復(fù)雜微生物，數(shù)據(jù)分析受到讀長(zhǎng)限制，較長(zhǎng)讀長(zhǎng)能夠使組裝更加準(zhǔn)確。PacBio等三代測(cè)序平臺(tái)采用單分子測(cè)序技術(shù)，無(wú)需擴(kuò)增DNA分子即可測(cè)得基因序列，并且讀長(zhǎng)更長(zhǎng)，有效彌補(bǔ)了二代測(cè)序的局限性。PacBio對(duì)16S rDNA的準(zhǔn)確度和覆蓋度都較低［25］，但通過(guò)改進(jìn)可直接測(cè)得16S rDNA全長(zhǎng)，準(zhǔn)確度可由之前的80%提高到99%［26］。

1.3 數(shù)據(jù)分析

宏基因組學(xué)數(shù)據(jù)分析內(nèi)容包括擴(kuò)增子測(cè)序分析以及全基因組測(cè)序分析。擴(kuò)增子測(cè)序首先生成操作性分類單位（Operational taxonomic unit，OTU），之后進(jìn)行物種群落和多樣性分析，包括Alpha多樣性、Beta 多樣性分析和系統(tǒng)發(fā)育分析等［27］。全基因組測(cè)序產(chǎn)生海量數(shù)據(jù)，涉及大量不同物種，數(shù)據(jù)分析難度大，主要包括數(shù)據(jù)的拼接組裝、基因預(yù)測(cè)、功能注釋等［28］?；蚪M裝（Genome assembly）將測(cè)序得到的堿基片段經(jīng)過(guò)拼接和組裝得到較長(zhǎng)片段堿基序列，目前針對(duì)第二代測(cè)序技術(shù)，主流算法是基于圖論的de Bruijn Graph（DBG）算法［29］；基因預(yù)測(cè)一般用于預(yù)測(cè) DNA 序列中編碼蛋白質(zhì)氨基酸序列的部分，即預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)基因，目前有基于序列相似性和基于統(tǒng)計(jì)學(xué)模型的兩種預(yù)測(cè)方法［30］；在進(jìn)行基因預(yù)測(cè)之后，將基因或蛋白序列在特定的數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索比對(duì)，從而完成功能注釋分析。

目前已有專門用于宏基因組分析的流程化軟件和工具，如 QIIME［31］、MEGAN［32］等，但分析計(jì)算量巨大，通常依賴于大型高性能計(jì)算平臺(tái)，可以部署在高性能計(jì)算機(jī)上，并可在完成拼接、比對(duì)等高計(jì)算要求后，將結(jié)果傳輸?shù)絺€(gè)人電腦進(jìn)行后續(xù)進(jìn)化、聚類、生物多樣性等分析。也可以利用宏基因組云計(jì)算平臺(tái)，如 IMG-M（http://img.jgi.doe.gov/m）［33］，Galaxy（http://g2.bx.psu.edu）［34］和 MG-RAST（http://metagenomics.anl.gov/）［35］等進(jìn)行常規(guī)宏基因組分析，通過(guò)在線儲(chǔ)存、定位進(jìn)行數(shù)據(jù)共享，使海量資源得到充分利用。宏基因組測(cè)序數(shù)據(jù)中包含多類物種，通過(guò)算法優(yōu)化來(lái)解決海量數(shù)據(jù)快速分析問(wèn)題，如Li等［36］開發(fā)的針對(duì)宏基因組大數(shù)據(jù)量的快速聚類算法，這類生物信息學(xué)分析工具極大促進(jìn)了宏基因組的發(fā)展。

2 宏基因組在傳染病防控中的應(yīng)用

基于高通量測(cè)序的宏基因組學(xué)可以得到樣本中全部物種的基因組，從而能同時(shí)識(shí)別所有致病病原體，極大減少逐個(gè)排除可疑病原所耗費(fèi)的時(shí)間及人力物力，并可對(duì)未知病原或已知變異較大病原進(jìn)行識(shí)別，為傳染病防控帶來(lái)新的思路。目前，宏基因組在公共衛(wèi)生監(jiān)測(cè)、病原檢測(cè)以及傳染病溯源等方面得到了廣泛應(yīng)用。

2.1 病原監(jiān)測(cè)

采集某一地區(qū)或人群的臨床樣本、食品和媒介生物等各類樣本進(jìn)行宏基因組學(xué)測(cè)序，監(jiān)測(cè)潛在致病病原，對(duì)可能出現(xiàn)的疫情進(jìn)行預(yù)測(cè)預(yù)警，可有效預(yù)防突發(fā)公共衛(wèi)生事件發(fā)生。

宏基因組能夠克服傳統(tǒng)方法的局限性，實(shí)現(xiàn)病原的高精度識(shí)別，為日常病原監(jiān)測(cè)提供指導(dǎo)。Fischer等［37］收集了24例季節(jié)性流感患者支氣管肺泡灌洗液、痰液和咽拭子樣本，實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示H3N2和H1N1呈陽(yáng)性，但不能進(jìn)一步分型，通過(guò)宏基因組測(cè)序并與已報(bào)道的基因組比對(duì)，能精確其具體型別，而且在部分樣本中發(fā)現(xiàn)其它病毒或細(xì)菌的混合感染。此外，對(duì)特定癥候人群進(jìn)行病原監(jiān)測(cè)，能預(yù)測(cè)傳染病暴發(fā)，并對(duì)出現(xiàn)相似癥狀的患者預(yù)警。研究者使用波多黎各、剛果、加利福尼亞等地區(qū)急性發(fā)熱病人的血液樣本，未分離培養(yǎng)直接提取核酸后進(jìn)行測(cè)序，分別檢測(cè)到基孔肯雅病毒，埃博拉病毒和丙型肝炎病毒，并且使用PCR驗(yàn)證結(jié)果［38］。一項(xiàng)研究使用宏基因組監(jiān)測(cè)呼吸道疾病，采集210例患者鼻咽抽吸樣本，提取核酸后分別進(jìn)行DNA和RNA建庫(kù)測(cè)序，在樣本中檢測(cè)到副黏病毒科、正黏病毒科和小RNA病毒科等多種病毒，發(fā)現(xiàn)一種新型鼻病毒，收集這些臨床樣本信息能建立預(yù)警機(jī)制，在出現(xiàn)異常時(shí)能快速判斷可能造成疫情的病原微生物，防止新突發(fā)傳染病的發(fā)生［39］。

隨著全球化貿(mào)易的發(fā)展，病原借助于食品進(jìn)行傳播的風(fēng)險(xiǎn)加大，食品監(jiān)測(cè)日益重要，但受限于檢測(cè)范圍，不能完全排除食物攜帶病原的可能性。Temmam等［40］通過(guò)對(duì)進(jìn)口動(dòng)物肉制品進(jìn)行宏基因組測(cè)序，檢測(cè)到冠狀病毒、黃病毒、痘病毒、漢坦病毒等可能感染人類的病毒，表明其可能存在致病風(fēng)險(xiǎn)。Ng等［41］對(duì)墨西哥灣捕獲的12只健康北方粉紅蝦進(jìn)行宏基因組檢測(cè)，在樣本中發(fā)現(xiàn)了諾達(dá)病毒和一種新型的環(huán)狀單鏈DNA病毒，需要對(duì)食品可能造成的病原傳播提高警惕。宏基因組對(duì)食品的病原監(jiān)測(cè)有助于阻止病原體從境外流入和擴(kuò)散，預(yù)防食源性傳染病的發(fā)生。

相同策略的宏基因組研究方法也可監(jiān)測(cè)媒介生物，評(píng)估病原體感染人類的可能性，預(yù)防人畜共患病發(fā)生。為評(píng)估野生老鼠攜帶病毒對(duì)人類的致病風(fēng)險(xiǎn)，研究者采集了德國(guó)柏林地區(qū)20只野生老鼠的腸道提取物樣本并進(jìn)行測(cè)序，檢測(cè)到博卡病毒、沙波病毒、諾瓦克病毒和輪狀病毒等多種病原，其中的輪狀病毒株與人類致病密切相關(guān)［42］。Coffey等［43］對(duì)澳大利亞蚊子進(jìn)行研究，分別提取其DNA和RNA進(jìn)行深度測(cè)序，檢測(cè)到羅斯河病毒、黃病毒、環(huán)狀病毒等多種潛在致病微生物，這對(duì)于預(yù)防蟲媒傳染病，防止其大規(guī)模暴發(fā)具有重要意義。

2.2 病原檢測(cè)

不明原因疾病和未知病原增加了臨床診斷難度，無(wú)法進(jìn)行有效治療，導(dǎo)致患者病情加重甚至死亡。通過(guò)測(cè)序樣本，并結(jié)合傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室診斷方法進(jìn)行驗(yàn)證，宏基因組學(xué)在病原檢測(cè)中發(fā)揮日益重要的作用。

宏基因組檢測(cè)能夠得到病原全部基因信息，在更深入的層次上探究病原感染原因。研究顯示，埃博拉病毒治愈后，病毒抗體可在體內(nèi)持續(xù)至少10年，復(fù)發(fā)幾率極低［44］。一名埃博拉患者治愈出院9個(gè)月之后出現(xiàn)復(fù)發(fā)癥狀，用PCR檢測(cè)到了埃博拉病毒，但是不能確定是原病毒還是新變異病毒的感染。為了研究再次感染的原因，研究者采取病人腦脊液和血清進(jìn)行宏基因組測(cè)序，檢測(cè)到的序列與初次發(fā)病的序列僅有兩個(gè)非編碼區(qū)的變化，調(diào)整治療方案后患者病情好轉(zhuǎn)［45］。這項(xiàng)研究重新說(shuō)明了埃博拉病毒具有復(fù)發(fā)的可能性，不能停止對(duì)埃博拉康復(fù)患者的檢測(cè)，這對(duì)于疫情治療和控制具有重要作用。

2011年德國(guó)暴發(fā)了急性腸出血性流行病，疫情初期沒(méi)有特異性手段檢測(cè)病原感染，而分離培養(yǎng)耗時(shí)長(zhǎng)且比較困難。在對(duì)此次疫情進(jìn)行回顧性研究中，Loman等［46］采用宏基因組檢測(cè)方法，采取40例疫情暴發(fā)期間的產(chǎn)志賀毒素型大腸桿菌（STEC）陽(yáng)性糞便樣本，并使用5例STEC陰性腹瀉樣本作為對(duì)照，未經(jīng)分離培養(yǎng)直接提取DNA進(jìn)行測(cè)序。于STEC陽(yáng)性患者的樣本中檢測(cè)到該疾病的致病菌株STEC O104∶H4，并且進(jìn)一步檢測(cè)到產(chǎn)志賀毒素的基因片段，在5例對(duì)照組中也檢測(cè)到了艱難梭菌、空腸彎曲桿菌和沙門氏菌的感染。表明了宏基因組使用非培養(yǎng)樣本檢測(cè)病原體并分析其毒力的潛力。

2007-2010年河南暴發(fā)了發(fā)熱伴血小板減少綜合征（Fever，thrombocyte-penia and leukopenia syndrome，F(xiàn)TLS）疫情，初始使用反轉(zhuǎn)錄PCR、PCR和免疫熒光血清學(xué)分析檢測(cè)了黃病毒科、日本腦炎病毒、披膜病毒科等可能微生物，均未能確定致病病原。Xu等［47］收集了285例患者的急性期血清樣本，之后將未分離培養(yǎng)的樣本直接進(jìn)行宏基因組測(cè)序，檢測(cè)到了一種新型病毒序列，通過(guò)比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)其與已知布尼亞病毒科具有遺傳相似性，是布尼亞病毒科白蛉病毒屬的新成員。隨后根據(jù)測(cè)得的基因序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，以及使用免疫熒光血清學(xué)分析，結(jié)果均呈陽(yáng)性，并對(duì)患者血清進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)，成功分離出此病毒，最終確定了導(dǎo)致此次疫情的就是新型布尼亞病毒。

德國(guó)一名患者出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征（Acute respiratory distress syndrome，ARDS）的癥狀，使用PCR和分離培養(yǎng)方法檢測(cè)流感病毒、腺病毒、肺炎支原體、肺炎衣原體等多種病原均為陰性，使用抗生素治療無(wú)效，患者在6日后死亡。當(dāng)?shù)诙嗤Y狀患者出現(xiàn)時(shí)，F(xiàn)isher等［48］使用宏基因組方法，采集患者的支氣管肺泡灌洗樣本，提取核酸后進(jìn)行二代測(cè)序，在50 h內(nèi)快速確定了致病病原是鸚鵡熱衣原體，隨后根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，使用PCR驗(yàn)證了檢測(cè)結(jié)果，并對(duì)患者進(jìn)行針對(duì)性的抗生素治療，患者病情減輕。第三例患者曾與第二例患者進(jìn)行接觸，并出現(xiàn)同樣癥狀，推測(cè)是第二例患者導(dǎo)致的感染，采用前述抗生素治療后患者迅速好轉(zhuǎn)。宏基因組對(duì)不明原因疾病患者的診斷，有助于及時(shí)求治患者，并為后續(xù)患者的診斷治療提供指導(dǎo)。

病毒、細(xì)菌和真菌等多種病原微生物均可引起腦膜炎，逐一排查可疑病原體費(fèi)時(shí)費(fèi)力。北京協(xié)和醫(yī)院4例患者臨床診斷為疑似病毒性腦膜炎，通過(guò)測(cè)序2例患者腦脊液樣本，檢測(cè)到單純皰疹病毒1型（HSV-1），另外兩名患者樣本中檢測(cè)到單純皰疹病毒2型（HSV-2）和人類皰疹病毒3型（HHV-3），并隨后通過(guò)PCR對(duì)其中3例進(jìn)行確認(rèn)［49］。2014年北京3例腦膜炎患者被診斷為疑似李斯特菌感染，但對(duì)樣本進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)結(jié)果為陰性，研究者對(duì)患者的腦脊液進(jìn)行了直接測(cè)序，檢測(cè)到李斯特菌序列，并利用PCR進(jìn)一步驗(yàn)證，確認(rèn)是李斯特菌引起的感染［50］。以上研究表明宏基因組具有檢測(cè)罕見病原感染的能力，基于測(cè)序的快速診斷對(duì)于應(yīng)對(duì)未知原因且致命的腦膜炎感染至關(guān)重要。

器官移植患者容易發(fā)生異常感染，宏基因組方法能夠確定感染患者的致病病原。一名2歲男孩在干細(xì)胞移植后出現(xiàn)高燒，紅疹和全身皮膚變黑等癥狀，使用分離培養(yǎng)和PCR檢測(cè)可疑病原均為陰性，常規(guī)抗生素治療均無(wú)效，Ye等［51］對(duì)患者血液樣本進(jìn)行二代測(cè)序，檢測(cè)出痤瘡丙酸桿菌感染，并在臨床治療上調(diào)整抗生素治療方法，患者迅速好轉(zhuǎn)。三名患者接受同一位捐贈(zèng)者的肝移植或腎移植，捐贈(zèng)者之后因腦出血死亡，三名接受者也先后因腦病死亡，推測(cè)可能由病原感染造成。使用分離培養(yǎng)和PCR方法檢測(cè)皰疹病毒、狂犬病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、弓形蟲、結(jié)核桿菌等病原體，均未檢測(cè)到致病病原。Palacios等［52］采取捐贈(zèng)者和接收者腦脊液、血液、腎臟、肝臟等樣本，提取RNA進(jìn)行測(cè)序，檢測(cè)到一種新型沙粒病毒，隨后設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR、分離培養(yǎng)和血清學(xué)檢測(cè)，均證實(shí)了結(jié)果。此外，一例12歲患者在腎臟移植后出現(xiàn)發(fā)燒、畏寒、身體疼痛等癥狀，使用PCR和血清學(xué)檢測(cè)一系列病原均為陰性，研究者通過(guò)對(duì)腦脊液樣本進(jìn)行宏基因組測(cè)序，檢測(cè)到了西尼羅病毒的序列，在進(jìn)行針對(duì)性治療后患者迅速好轉(zhuǎn)，并在恢復(fù)期檢測(cè)到西尼羅病毒抗體，證實(shí)了西尼羅病毒的感染［53］。值得關(guān)注的是，在病人急性期使用血清學(xué)檢測(cè)西尼羅病毒，可能由于免疫抑制作用，結(jié)果呈現(xiàn)假陰性，并且由于腦脊液中西尼羅病毒的反轉(zhuǎn)錄PCR敏感性較差，未使用反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)西尼羅病毒。宏基因組方法在此情況下發(fā)揮作用，說(shuō)明其具有較強(qiáng)的病原檢測(cè)能力。

此外，許多新型病原可導(dǎo)致臨床病例，難以通過(guò)傳統(tǒng)微生物技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，而宏基因組測(cè)序使發(fā)現(xiàn)新病原成為可能。一名澳大利亞兒童的急性腹瀉樣本在使用分離培養(yǎng)、免疫學(xué)診斷、PCR等方法檢測(cè)后，輪狀病毒、星狀病毒、腺病毒和常見細(xì)菌等病原體結(jié)果均為陰性。Holtz等［54］采用宏基因組方法直接從糞便樣本提取RNA進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了一種與已知柯薩奇病毒相似的序列，通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)其基因序列不符合納入現(xiàn)有物種的標(biāo)準(zhǔn)，推測(cè)其為柯薩奇病毒屬內(nèi)新的物種并命名為Human Cosavirus E1（HCoSV-E1）。雖然這些病毒的流行和臨床意義目前未知，但這些病毒可能對(duì)人類健康產(chǎn)生影響，而宏基因組檢測(cè)能夠幫助了解這些病毒的免疫和發(fā)育信息并為預(yù)防和控制帶來(lái)新思路。

2.3 病原溯源

在調(diào)查傳染病疫情時(shí)，宏基因組學(xué)在對(duì)樣本進(jìn)行測(cè)序后，還可以構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹等對(duì)病原進(jìn)行追溯，找到潛在傳播途徑，及時(shí)確定和切斷感染源，進(jìn)而為制定公共衛(wèi)生策略提供重要依據(jù)。

寨卡病毒通過(guò)蚊蟲叮咬傳播，孕婦感染后可導(dǎo)致新生兒小頭癥，2016年寨卡病毒疫情暴發(fā)引起了廣泛的關(guān)注［55］。研究者通過(guò)對(duì)兩例孕婦患者的羊水樣本直接進(jìn)行高通量測(cè)序，檢測(cè)到寨卡病毒的全基因組，表明寨卡病毒可以穿過(guò)胎盤屏障感染胎兒，隨后利用PCR和ELISA驗(yàn)證檢測(cè)結(jié)果，進(jìn)一步全基因組系統(tǒng)發(fā)育分析顯示其與法屬波利尼西亞的寨卡病毒具有97-100%的相似度，這為建立寨卡病毒和小頭癥的聯(lián)系及確定病毒來(lái)源提供了重要參考［56］。此外，Quick等［57］發(fā)展了直接對(duì)臨床樣本測(cè)序的方法，通過(guò)多重PCR富集病毒基因組，并同時(shí)采用MinION和Illumina進(jìn)行測(cè)序分析，可以得到病毒全部序列?；谏鲜龇椒?，Guerbois等［58］獲得感染患者的寨卡病毒序列，通過(guò)比對(duì)及溯源分析，發(fā)現(xiàn)該序列和北美地區(qū)埃及伊蚊中的病毒序列相似，推測(cè)病毒從危地馬拉傳入，并可能繼續(xù)向北擴(kuò)散，這為防止寨卡病毒進(jìn)一步傳播提供指導(dǎo)。

2011年，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院臨床中心暴發(fā)了耐碳青霉烯藥物病原疫情，造成18例感染和11例死亡。初始使用PCR和PFGE分析檢測(cè)到肺炎克雷伯菌，但未能進(jìn)一步區(qū)分患者菌株之間的差異以及對(duì)疫情深入研究。Snitkin等［59］使用宏基因組方法對(duì)此次疫情做了調(diào)查，測(cè)序得到菌株全基因組，序列分析顯示其屬于肺炎克雷伯菌NTUH-K2044型，并且檢測(cè)到碳青霉烯藥物的耐藥基因，之后通過(guò)分析全基因組序列確定菌株之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，結(jié)合流行病學(xué)調(diào)查，推測(cè)病原在18位患者之間的傳播路徑。值得關(guān)注的是，宏基因組分析傳播路徑結(jié)果顯示病原不僅可以在相同病房?jī)?nèi)，還能在不同病房之間傳播，表明本次疫情可能具有更復(fù)雜的傳播方式，亟需加強(qiáng)對(duì)無(wú)癥狀人員和設(shè)備儀器等進(jìn)行監(jiān)測(cè)。在應(yīng)對(duì)新突發(fā)疫情過(guò)程中，宏基因組方法能夠獲得樣本毒力耐藥信息，為治療提供幫助。此外，把基因組數(shù)據(jù)與流行病學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行整體考慮，將遺傳信息與樣本提取的時(shí)間和位置結(jié)合，能夠有效對(duì)疫情調(diào)查追溯，推測(cè)病原傳播的過(guò)程和方式，對(duì)傳染病的傳播進(jìn)行阻斷。

流感病毒突變率和譜系可能對(duì)不同亞種的表型和抗原性起重要作用，對(duì)不同型別流感病毒進(jìn)化關(guān)系追溯有利于更深刻地認(rèn)識(shí)其變異傳播規(guī)律，從而為防控提供依據(jù)。Yu等［60］通過(guò)收集患者呼吸道樣本和當(dāng)?shù)丶仪菁S便、咽拭子等樣本，利用宏基因組測(cè)序方法，在人類樣本中檢測(cè)到H7N9病毒，在家禽樣本中則檢測(cè)到H7N9和H9N2的共存，并對(duì)人和家禽樣本均用PCR進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)H7N9的演化受到H9N2影響。

宏基因組得到病原基因組后，能準(zhǔn)確比對(duì)其序列，判斷病原源頭。2010年烏干達(dá)醫(yī)院報(bào)告疑似出血熱病例，McMullan等［61］從4名病人的血液樣本直接提取RNA進(jìn)行測(cè)序，檢測(cè)到黃熱病毒序列，系統(tǒng)發(fā)育分析將其與非洲各地報(bào)道過(guò)的毒株進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果顯示，以往烏干達(dá)出現(xiàn)的黃熱病毒與非洲東部和中部地區(qū)的序列具有同源性，并且大多數(shù)黃熱病毒具有地理聚集性。但是此次病例基因型不同于之前烏干達(dá)地區(qū)報(bào)道的基因組，而是與中非共和國(guó)特有的毒株具有相似性，揭示了可能的傳播來(lái)源。

利用宏基因組方法還可以對(duì)一些歷史疫情或病例進(jìn)行研究，從而對(duì)傳染病病原進(jìn)行時(shí)空溯源。Keller等［62］從冰木乃伊的骨骸中提取了0.1 g骨活性組織并進(jìn)行直接測(cè)序，檢測(cè)到伯氏疏螺旋體菌，識(shí)別到目前已知最早的萊姆病患者。研究者收集了來(lái)自英國(guó)、丹麥、瑞典的距今1010-1383年共計(jì)22例骨骼和牙齒樣本，使用宏基因組測(cè)序方法檢測(cè)到麻風(fēng)桿菌，并通過(guò)分析不同地區(qū)麻風(fēng)桿菌的序列差異，探究麻風(fēng)桿菌的起源與演變，推測(cè)美洲麻風(fēng)病可能來(lái)源于歐洲，并且中東地區(qū)麻風(fēng)桿菌基因型與中世紀(jì)歐洲地區(qū)基因型相關(guān)［63］。Chan等［64］對(duì)一名1797年的木乃伊肺部殘留組織樣本提取核酸后進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)其受到分布在歐洲和北美地區(qū)的兩種不同基因型結(jié)核分枝桿菌的混合感染，這對(duì)研究結(jié)核分枝桿菌在世界范圍內(nèi)傳播的過(guò)程具有重要意義。

3 展望

雖然宏基因組學(xué)是一項(xiàng)強(qiáng)有力的工具，但是其仍有一些局限性待解決和進(jìn)一步發(fā)展。理論上宏基因組可以應(yīng)用于任何樣本，對(duì)不同類型病原體（如病毒、細(xì)菌、真菌和寄生蟲等）都可以進(jìn)行檢測(cè)，但臨床、環(huán)境等樣本收集處理存在較多變量和不確定性，不同樣本所含微生物復(fù)雜程度不同，因此建立并優(yōu)化不同樣本收集及處理標(biāo)準(zhǔn)化操作流程，有助于降低污染風(fēng)險(xiǎn)，并減少因分析流程不統(tǒng)一導(dǎo)致的分析結(jié)果偏差。

傳染病感染樣本復(fù)雜且含有大量非目的微生物核酸，當(dāng)樣本核酸濃度較低時(shí)，宏基因組測(cè)定序列難以實(shí)現(xiàn)致病病原高覆蓋，導(dǎo)致數(shù)據(jù)分析的準(zhǔn)確率和可靠性下降，尤其是全基因組測(cè)序分析比16S rDNA擴(kuò)增分析需要更高的覆蓋，如何提高感染病原核酸濃度及宏基因組測(cè)序序列精度是一個(gè)值得考慮的問(wèn)題。且臨床樣本中人類基因組含量較高，在采取預(yù)防性措施的前提下，在50%-90%的序列中仍發(fā)現(xiàn)了人類基因，說(shuō)明去除樣本中人類核酸的技術(shù)仍存在較大發(fā)展空間［65］。此外，用于宏基因組分析的參考數(shù)據(jù)庫(kù)還不夠完善，大量測(cè)序數(shù)據(jù)無(wú)法進(jìn)行有效匹配，這對(duì)于病毒分析尤其嚴(yán)重，研究顯示80%或更多病毒的序列缺少與之相應(yīng)的匹配［66］。相比傳統(tǒng)檢測(cè)，宏基因組方法可將病原檢出率由12.82%（10/78）提高到30.77%（24/78），宏基因組測(cè)序雖然可以獲得樣本序列信息，但仍難以直接確認(rèn)致病病原，無(wú)法滿足診治需求，需要對(duì)其進(jìn)一步發(fā)展以適應(yīng)臨床需要［67］。

在病原識(shí)別后的生物信息學(xué)分析過(guò)程中，如何將臨床表型和基因型結(jié)合起來(lái)以及挖掘?qū)魅静》揽赜杏玫男畔⑹且粋€(gè)挑戰(zhàn)。解決這一問(wèn)題仍需要宏基因組學(xué)與傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)手段相結(jié)合，如在宏基因組檢測(cè)到病原后使用PCR或分離培養(yǎng)方法進(jìn)行確認(rèn)，在檢測(cè)到耐藥基因后調(diào)整藥物治療方案以提高治療效果等。其次，有研究表明，在序列分析過(guò)程中，人類閱讀和分析隱私問(wèn)題也值得關(guān)注［68-69］，如何在病原檢測(cè)過(guò)程中盡可能地保護(hù)患者隱私，避免出現(xiàn)因基因組測(cè)序?qū)е碌膫惱韱?wèn)題，需要重點(diǎn)考慮。

在傳染病病原檢測(cè)中，時(shí)效性是一個(gè)重要問(wèn)題，病原診斷的周轉(zhuǎn)時(shí)間（Turn around time，TAT）是判斷病原檢測(cè)有效性的可靠指標(biāo)。Goswami等［70］進(jìn)行了為期一年的調(diào)查研究，對(duì)臨床樣本的TAT進(jìn)行評(píng)估，結(jié)論是住院樣本的TAT為5.5 h，門診樣本的TAT是24 h。針對(duì)臨床樣本的TAT，宏基因組測(cè)序和分析的速度亟需加快。如何提高測(cè)序速度是目前宏基因組發(fā)展的一個(gè)重要問(wèn)題。

宏基因組是一個(gè)有活力的領(lǐng)域，運(yùn)用宏基因組學(xué)技術(shù)進(jìn)行病原監(jiān)測(cè)、檢測(cè)和溯源，應(yīng)對(duì)新突發(fā)傳染病疫情，成功打開了宏基因組學(xué)在公共衛(wèi)生和疾病防控領(lǐng)域的應(yīng)用大門，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，宏基因組學(xué)分析流程和算法也不斷更新和完善。宏基因組學(xué)相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用也正在受到越來(lái)越廣泛的關(guān)注。

［1］ Fouchier RA, Kuiken T, Schutten M, et al. Aetiology：Koch’s postulates fulfilled for SARS virus［J］. Nature, 2003, 423（6937）：240.

［2］ Smith RD. Responding to global infectious disease outbreaks：lessons from SARS on the role of risk perception, communication and management［J］. Soc Sci Med, 2006, 63（12）：3113-3123.

［3］ Torsvik V, Ovreas L. Microbial diversity and function in soil：from genes to ecosystems［J］. Curr Opin Microbiol, 2002, 5（3）：240-245.

［4］ Roingeard P. Viral detection by electron microscopy：past, present and future［J］. Biol Cell, 2008, 100（8）：491-501.

［5］ Doane FW. Immunoelectron microscopy in diagnostic virology［J］.Ultrastruct Pathol, 1987, 11（5-6）：681-685.

［6］ Rose TM. CODEHOP-mediated PCR - a powerful technique for the identification and characterization of viral genomes［J］. Virol J,2005, 2：20.

［7］ Ambrose HE, Granerod J, Clewley JP, et al. Diagnostic strategy used to establish etiologies of encephalitis in a prospective cohort of patients in england［J］. Journal of Clinical Microbiology, 2011, 49（10）：3576-3583.

［8］ Finkbeiner SR, Allred AF, Tarr PI, et al. Metagenomic analysis of human diarrhea：viral detection and discovery［J］. PLoS Pathog,2008, 4（2）：e1000011.

［9］ Handelsman J, Rondon MR, Brady SF, et al. Molecular biological access to the chemistry of unknown soil microbes：a new frontier for natural products［J］. Chem Biol, 1998, 5（10）：R245-249.

［10］ Chen K, Pachter L. Bioinformatics for whole-genome shotgun sequencing of microbial communities［J］. PLoS Comput Biol,2005, 1（2）：106-112.

［11］ Miller RR, Montoya V, Gardy JL, et al. Metagenomics for pathogen detection in public health［J］. Genome medicine, 2013, 5（9）：81.

［12］ Maukonen J, Simoes C, Saarela M. The currently used commercial DNA-extraction methods give different results of clostridial and actinobacterial populations derived from human fecal samples［J］. FEMS Microbiol Ecol, 2012, 79（3）：697-708.

［13］ Relman DA, Falkow S, Leboit PE, et al. The organism causing bacillary angiomatosis, peliosis hepatis, and fever and bacteremia in immunocompromised patients［J］. New England Journal of Medicine, 1991, 324（21）：1514.

［14］ Weisburg WG, Barns SM, Pelletier DA, et al. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study［J］. J Bacteriol, 1991, 173（2）：697-703.

［15］ Marchesi JR, Sato T, Weightman AJ, et al. Design and evaluation of useful bacterium-specific PCR primers that amplify genes coding for bacterial 16S rRNA［J］. Appl Environ Microbiol, 1998, 64（2）：795-799.

［16］ Klindworth A, Pruesse E, Schweer T, et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and nextgeneration sequencing-based diversity studies［J］. Nucleic Acids Res, 2013, 41（1）：e1.

［17］ Claesson MJ, O’sullivan O, Wang Q, et al. Comparative analysis of pyrosequencing and a phylogenetic microarray for exploring microbial community structures in the human distal intestine［J］.PLoS One, 2009, 4（8）：e6669.

［18］ Thurber RV, Haynes M, Breitbart M, et al. Laboratory procedures to generate viral metagenomes. ［J］. Nat Protoc, 2009, 4（4）：470-483.

［19］ Del Sal G, Manfioletti G, Schneider C. The CTAB-DNA precipitation method：a common mini-scale preparation of template DNA from phagemids, phages or plasmids suitable for sequencing. ［J］. Biotechniques, 1989, 7（5）：514-520.

［20］ Tsai Y-L, Olson BH. Rapid method for direct extraction of DNA from soil and sediments. ［J］. Appl Environ Microbiol, 1991, 57（4）：1070-1074.

［21］ Simms D, Cizdziel PE, Chomczynski P. TRIzol：A new reagent for optimal single-step isolation of RNA［J］. Focus, 1993, 15（4）：532-535.

［22］ Grant P, Sims C, Krieg-Schneider F, et al. Automated screening of blood donations for hepatitis C virus RNA using the Qiagen BioRobot 9604 and the Roche COBAS HCV Amplicor assay［J］.Vox Sanguinis, 2002, 82（4）：169-176.

［23］Jonasson J, Olofsson M, Monstein HJ. Classification, identification and subtyping of bacteria based on pyrosequencing and signature matching of 16S rDNA fragments［J］. Apmis, 2002, 110（3）：263-272.

［24］Salipante SJ, Kawashima T, Rosenthal C, et al. Performance comparison of Illumina and ion torrent next-generation sequencing platforms for 16S rRNA-based bacterial community profiling［J］.Appl Environ Microbiol, 2014, 80（24）：7583-7591.

［25］Mosher JJ, Bernberg EL, Shevchenko O, et al. Efficacy of a 3rd generation high-throughput sequencing platform for analyses of 16S rRNA genes from environmental samples［J］. J Microbiol Methods, 2013, 95（2）：175-181.

［26］Mosher JJ, Bowman B, Bernberg EL, et al. Improved performance of the PacBio SMRT technology for 16S rDNA sequencing［J］. J Microbiol Methods, 2014, 10：459-460.

［27］Aagaard K, Riehle K, Ma J, et al. A metagenomic approach to characterization of the vaginal microbiome signature in pregnancy［J］. PLoS One, 2012, 7（6）：e36466.

［28］Lasken RS, Mclean JS. Recent advances in genomic DNA sequencing of microbial species from single cells［J］. Nat Rev Genet, 2014, 15（9）：577-584.

［29］Berger B, Peng J, Singh M. Computational solutions for omics data［J］. Nat Rev Genet, 2013, 14（5）：333-346.

［30］張恩民, 海榮, 俞東征. 基因預(yù)測(cè)方法的研究進(jìn)展［J］. 中國(guó)媒介生物學(xué)及控制雜志, 2009（3）：271-273.

［31］Caporaso JG, Kuczynski J, Stombaugh J, et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data［J］. Nat Methods, 2010, 7（5）：335-336.

［32］Huson DH, Auch AF, Qi J, et al. MEGAN analysis of metagenomic data［J］. Genome Res, 2007, 17（3）：377-386.

［33］Markowitz VM, Ivanova NN, Szeto E, et al. IMG/M：a data management and analysis system for metagenomes［J］. Nucleic Acids Res, 2008, 36（Database issue）：D534-538.

［34］Giardine B, Riemer C, Hardison RC, et al. Galaxy：a platform for interactive large-scale genome analysis［J］. Genome Research,2005, 15（10）：1451-1455.

［35］Meyer F, Paarmann D, D’souza M, et al. The metagenomics RAST server-a public resource for the automatic phylogenetic and functional analysis of metagenomes［J］. BMC Bioinformatics,2008, 9（1）：386.

［36］Li W, Wooley JC, Godzik A. Probing metagenomics by rapid cluster analysis of very large datasets［J］. PLoS One, 2008, 3（10）：e3375.

［37］Fischer N, Indenbirken D, Meyer T, et al. Evaluation of unbiased next-generation sequencing of RNA（RNA-seq）as a diagnostic method in influenza virus-positive respiratory samples［J］. J Clin Microbiol, 2015, 53（7）：2238-2250.

［38］Greninger AL, Naccache SN, Federman S, et al. Rapid metagenomic identification of viral pathogens in clinical samples by real-time nanopore sequencing analysis［J］. Genome medicine, 2015, 7 ：99.

［39］Lysholm F, Wetterbom A, Lindau C, et al. Characterization of the viral microbiome in patients with severe lower respiratory tract infections, using metagenomic sequencing［J］. PLoS One, 2012,7（2）：e30875.

［40］Temmam S, Davoust B, Chaber AL, et al. Screening for viral pathogens in African simian bushmeat seized at a French airport［J］. Transboundary and Emerging Diseases, 2016, 64（4）：1159-1167.

［41］Ng TF, Alavandi S, Varsani A, et al. Metagenomic identification of a nodavirus and a circular ssDNA virus in semi-purified viral nucleic acids from the hepatopancreas of healthyFarfantepenaeus duorarumshrimp［J］. Dis Aquat Organ, 2013, 105（3）：237-242.

［42］Sachsenroder J, Braun A, Machnowska P, et al. Metagenomic identification of novel enteric viruses in urban wild rats and genome characterization of a group A rotavirus［J］. J Gen Virol, 2014, 95（Pt 12）：2734-2747.

［43］Coffey LL, Page BL, Greninger AL, et al. Enhanced arbovirus surveillance with deep sequencing：Identification of novel rhabdoviruses and bunyaviruses in Australian mosquitoes［J］.Virology, 2014, 448（448）：146.

［44］Ksiazek TG, West CP, Rollin PE, et al. ELISA for the detection of antibodies to Ebola viruses［J］. J Infect Dis, 1999, 179（Suppl1）S192-S198.

［45］Jacobs M, Rodger A, Bell DJ, et al. Late Ebola virus relapse causing meningoencephalitis：a case report. ［J］. Lancet, 2016,388（10043）：498-503.

［46］Loman NJ, Constantinidou C, Christner M, et al. A cultureindependent sequence-based metagenomics approach to the investigation of an outbreak of Shiga-toxigenic Escherichia coliO104：H4［J］. JAMA, 2013, 309（14）：1502-1510.

［47］Xu B, Liu L, Huang X, et al. Metagenomic analysis of fever,thrombocytopenia and leukopenia syndrome（FTLS）in Henan Province, China：discovery of a new bunyavirus［J］. PLoS Pathog, 2011, 7（11）：e1002369.

［48］Fischer N, Rohde H, Indenbirken D, et al. Rapid metagenomic diagnostics for suspected outbreak of severe pneumonia［J］.Emerg Infect Dis, 2014, 20（6）：1072-1075.

［49］Guan H, Shen A, Lv X, et al. Detection of virus in CSF from the cases with meningoencephalitis by next-generation sequencing［J］. J Neurovirol, 2016, 22（2）：240-245.

［50］Yao M, Zhou J, Zhu Y, et al. Detection of Listeria monocytogenes in CSF from three patients with meningoencephalitis by Next-Generation Sequencing［J］. J Clin Neurol, 2016, 12（4）：446-451.

［51］Ye M, Wei W, Yang Z, et al. Rapid diagnosis ofPropionibacteriumacnes infection in patient with hyperpyrexia after hematopoietic stem cell transplantation by next-generation sequencing：a case report［J］. BMC Infect Dis, 2016, 16 ：5.

［52］Palacios G, Druce J, Du L, et al. A new arenavirus in a cluster of fatal transplant-associated diseases［J］. N Engl J Med, 2008, 358（10）：991-998.

［53］Wilson MR, Zimmermann LL, Crawford ED, et al. Acute west nile virus meningoencephalitis diagnosed via metagenomic deep sequencing of cerebrospinal fluid in a renal transplant patient［J］. Am J Transplant, 2017, 17（3）：803-808.

［54］Holtz LR, Finkbeiner SR, Kirkwood CD, et al. Identification of a novel picornavirus related to cosaviruses in a child with acute diarrhea［J］. Virol J, 2008, 5：159.

［55］Mlakar J, Korva M, Tul N, et al. Zika virus associated with microcephaly［J］. N Engl J Med, 2016, 374（10）：951-958.

［56］Calvet G, Aguiar RS, Melo AS, et al. Detection and sequencing of Zika virus from amniotic fluid of fetuses with microcephaly in Brazil：a case study［J］. Lancet Infect Dis, 2016, 16（6）：653-660.

［57］Quick J, Grubaugh ND, Pullan ST, et al. Multiplex PCR method for MinION and Illumina sequencing of Zika and other virus genomes directly from clinical samples［J］. Nat Protoc, 2017, 12（6）：1261-1276.

［58］Guerbois M, Fernandez-Salas I, Azar SR, et al. Outbreak of zika virus infection, chiapas state, mexico, 2015, and first confirmed transmission byAedes aegyptimosquitoes in the americas［J］. J Infect Dis, 2016, 214（9）：1349-1356.

［59］Snitkin ES, Zelazny AM, Thomas PJ, et al. Tracking a hospital outbreak of carbapenem-resistantKlebsiella pneumoniaewith whole-genome sequencing［J］. Sci Transl Med, 2012, 4（148）：148ra116.

［60］Yu X, Jin T, Cui Y, et al. Influenza H7N9 and H9N2 viruses：coexistence in poultry linked to human H7N9 infection and genome characteristics［J］. J Virol, 2014, 88（6）：3423-3431.

［61］Mcmullan LK, Frace M, Sammons SA, et al. Using next generation sequencing to identify yellow fever virus in Uganda［J］. Virology,2012, 422（1）：1-5.

［62］Keller A, Graefen A, Ball M, et al. New insights into the Tyrolean Iceman’s origin and phenotype as inferred by whole-genome sequencing［J］. Nature Communications, 2012, 3（698）：698.

［63］Schuenemann VJ, Singh P, Mendum TA, et al. Genome-wide comparison of medieval and modernMycobacterium leprae［J］.Science, 2013, 341（6142）：179-183.

［64］Chan JZ, Sergeant MJ, Lee OY, et al. Metagenomic analysis of tuberculosis in a mummy［J］. N Engl J Med, 2013, 369（3）：289-290.

［65］Human Microbiome Project C. A framework for human microbiome research［J］. Nature, 2012, 486（7402）：215-221.

［66］Reyes A, Haynes M, Hanson N, et al. Viruses in the faecal microbiota of monozygotic twins and their mothers［J］. Nature,2010, 466（7304）：334-338.

［67］Long Y, Zhang Y, Gong Y, et al. Diagnosis of sepsis with cellfree DNA by next-generation-sequencing technology in ICU patients［J］. Archives of Medical Research, 2016, 47（5）：365-371.

［68］ Callaway E. Microbiome privacy risk［J］. Nature, 2015, 521（7551）：136.

［69］Erlich Y, Narayanan A. Routes for breaching and protecting genetic privacy［J］. Nat Rev Genet, 2014, 15（6）：409-421.

［70］Goswami B, Singh B, Chawla R, et al. Turn around time（TAT）as a benchmark of laboratory performance［J］. Indian Journal of Clinical Biochemistry, 2010, 25（4）：376-379.