Survivin在紫杉醇誘導(dǎo)人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞凋亡中的作用

劉馨蓮，張錄順，陳柯宇

(成都醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610500)

膠質(zhì)瘤是最常見的顱內(nèi)原發(fā)惡性腫瘤，占顱內(nèi)腫瘤的35.26%～60.96%[1]，預(yù)后差，病死率高。臨床治療以外科手術(shù)為主，由于腫瘤組織與周圍腦組織分界不清，不易徹底切除，術(shù)后多輔以放化療。研究顯示，細(xì)胞凋亡調(diào)控分子的表達(dá)異常和功能紊亂在腦膠質(zhì)瘤發(fā)生與演進(jìn)中起著重要作用，其中Survivin的異常表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2]，而Survivin屬人類凋亡抑制蛋白(IAP)家族中的一員，也是迄今為止發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)大的凋亡抑制因子。紫杉醇(PTx)是從紅豆杉中分離出的一種化合物，現(xiàn)已被用于非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌等的化療，抗腫瘤效果良好。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是紫杉醇重要的作用機(jī)制，故紫杉醇極有可能與Survivin的異常表達(dá)相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)觀察了紫杉醇對(duì)腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞生長情況以及Survivin蛋白表達(dá)的影響，旨在探討紫杉醇治療腦膠質(zhì)瘤的機(jī)制。

1　實(shí)驗(yàn)資料

1.1材料人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞株來自成都醫(yī)學(xué)院細(xì)胞培養(yǎng)中心，紫杉醇為上海阿拉丁生化科技股份有限公司產(chǎn)品，Survivin抗體為武漢三鷹公司產(chǎn)品，MTT檢測試劑盒為江蘇凱基生物公司產(chǎn)品，胎牛血清為杭州四季青生物材料公司產(chǎn)品，DMEM培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品，其余常規(guī)試劑均購自武漢谷歌生物科技公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)U251細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)2～3 d換液或傳代1次。

1.2.2倒置顯微鏡觀察當(dāng)U251細(xì)胞生長至培養(yǎng)瓶的80%時(shí)，更換含有紫杉醇的培養(yǎng)液，設(shè)紫杉醇處理組(終濃度分別為10，100，1 000，10 000 nmol/L)和空白對(duì)照組(僅細(xì)胞培養(yǎng)液)，分別于紫杉醇作用6，12，24，48 h時(shí)在倒置顯微鏡下觀察U251細(xì)胞的生長情況。

1.2.3MTT實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長期的U251細(xì)胞，經(jīng)0.04%EDTA消化后，接種于96孔板，每孔100 μL(大約104個(gè)細(xì)胞)，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后進(jìn)行藥物干預(yù)。設(shè)紫杉醇處理組(終濃度分別為10，100，1 000，10 000 nmol/L)和空白對(duì)照組(完全培養(yǎng)基)，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后換液，每孔加入100 μL培養(yǎng)液、20 μL MTT液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入150 μL DMSO溶解，振蕩10 min左右至溶解完全，酶標(biāo)儀測550 nm波長處的OD值。藥物對(duì)細(xì)胞的生長抑制率=(對(duì)照組A值-用藥組A值)/對(duì)照組A值×100%。

1.2.4Western blot檢測不同濃度紫杉醇(10，100，1 000，10 000 nmol/L)作用24 h和相同濃度(100 nmol/L)紫杉醇作用不同時(shí)間(6，12，24，48 h)后，收集各組細(xì)胞，加入蛋白裂解緩沖液提取總蛋白，BCA法測蛋白濃度。制膠(10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠)、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，二抗(1∶2 000)，室溫孵育2 h，ECL法顯色，顯影、定影，Alpha軟件系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。

2　結(jié)　　果

2.1紫杉醇對(duì)人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞形態(tài)的影響在倒置顯微鏡下，空白對(duì)照組U251細(xì)胞貼壁生長狀態(tài)良好，胞質(zhì)透明，細(xì)胞輪廓清晰，折光性好。10 nmol/L紫杉醇處理U251細(xì)胞6 h后，細(xì)胞的貼壁能力減弱，少量細(xì)胞變圓、變小、皺縮、脫落漂浮于細(xì)胞培養(yǎng)液中。隨著紫杉醇藥物濃度的增高以及作用時(shí)間的延長，變小、變圓、脫落的細(xì)胞逐漸增多，部分黏附形成成簇的圓形小體。在10 000 nmol/L紫杉醇作用48 h后，大部分細(xì)胞脫落漂浮于細(xì)胞培養(yǎng)液中，僅少數(shù)細(xì)胞呈圓形貼壁生長，細(xì)胞生長受到明顯抑制。

2.2紫杉醇對(duì)U251細(xì)胞的生長抑制作用MTT檢測結(jié)果顯示，10，100，1 000，10 000 nmol/L紫杉醇組的細(xì)胞抑制率分別為5.98%，21.38%，27.94%，35.8%，紫杉醇對(duì)U251細(xì)胞的生長抑制率隨著藥物作用濃度的增加而逐漸升高(P<0.05)。

2.3紫杉醇對(duì)U251細(xì)胞中Survivin蛋白表達(dá)的影響100 nmol/L紫杉醇誘導(dǎo)的Survivin表達(dá)早在6 h已經(jīng)出現(xiàn)，隨著時(shí)間的延長，Survivin表達(dá)水平呈升高趨勢，見圖1。不同濃度紫杉醇處理24 h后，10 nmol/L紫杉醇誘導(dǎo)的Survivin表達(dá)水平最高，隨著藥物濃度的增加，Survivin表達(dá)水平并未顯示出簡單的線性關(guān)系，說明藥物干預(yù)需選擇合適的濃度，見圖2。

圖1　紫杉醇處理后6，12，24，48 h細(xì)胞中Survivin表達(dá)

圖2　不同濃度紫杉醇處理后細(xì)胞中Survivin表達(dá)

3　討　　論

紫杉醇是目前臨床上治療多種腫瘤的一線用藥，其抗腫瘤機(jī)制主要有：①通過與p微管蛋白結(jié)合，穩(wěn)定微管蛋白構(gòu)象，抑制細(xì)胞分裂、增殖[3]。②可誘導(dǎo)bcl-2高磷酸化[4]，以致其不能與bax結(jié)合，引起凋亡；還可激活Caspases-3、Caspases-8、STAT3、Ras/Raf等信號(hào)系統(tǒng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5-8]。③激活免疫系統(tǒng)[9]、抗腫瘤血管形成[10]等。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，紫杉醇處理過的人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞貼壁數(shù)量減少，折光性減弱，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡形態(tài)，提示紫杉醇對(duì)人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞具有明顯的生長抑制效應(yīng)，其效應(yīng)存在著劑量依賴關(guān)系。因此，進(jìn)一步研究紫杉醇誘導(dǎo)人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞凋亡的分子生物學(xué)機(jī)制對(duì)于臨床應(yīng)用將有很大的幫助。

1997年，Ambrosini等[4]篩選并分離出了一種新的可抑制細(xì)胞凋亡的基因，命名為Survivin。Survivin基因位于人體17q25染色體上，全長14.7 kb，由3個(gè)內(nèi)顯子和4個(gè)外顯子組成，是編碼16.5 kDa的蛋白質(zhì)[11]。Survivin主要特異性表達(dá)于人類胚胎和發(fā)育的胎兒組織中，廣泛表達(dá)于大多數(shù)腫瘤組織如肺癌、食管癌、胃癌、肝癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌、膠質(zhì)瘤等[12]。Survivin能通過細(xì)胞色素C、Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9等線粒體途徑抑制細(xì)胞凋亡，也能通過FasR、TNFR、Caspase-8等死亡受體途徑抑制細(xì)胞凋亡，還參與細(xì)胞周期調(diào)控[13]，其表達(dá)在G2/M期最高。Survivin還可以通過穩(wěn)定微管結(jié)構(gòu)，在有絲分裂過程中發(fā)揮重要作用[14]；其除了直接促進(jìn)腫瘤發(fā)生外，還可在血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖階段高表達(dá)，從而在腫瘤血管生成過程中發(fā)揮關(guān)鍵的促血管生成作用[15]。Survivin與化療耐藥、放療不敏感相關(guān)，靶向Survivin的小分子抑制劑、反義寡核苷酸等均已處于臨床研究中。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，100 nmol/L的紫杉醇處理人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞6 h后，Survivin蛋白表達(dá)水平即升高，且隨著作用時(shí)間延長，Survivin蛋白表達(dá)水平呈升高趨勢；采用不同濃度的紫杉醇干預(yù)人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞24 h后， 10 nmol/L紫杉醇組Survivin蛋白表達(dá)水平最高。說明在短時(shí)間內(nèi)紫杉醇即可誘導(dǎo)Survivin的高表達(dá)，這有可能是藥物作用的早期結(jié)果，這與Ling等[16]研究結(jié)果相符。隨著紫杉醇濃度的增加，Survivin蛋白表達(dá)水平有所降低，但Survivin表達(dá)水平并未顯示出簡單的線性關(guān)系，提示在臨床用藥過程中，任意提高藥物濃度對(duì)誘導(dǎo)U251細(xì)胞凋亡是無效的，應(yīng)選擇合適的藥物濃度。

綜上所述，紫杉醇對(duì)人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞具有明顯的生長抑制作用，其可以通過下調(diào)Survivin表達(dá)水平而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤生長，為其臨床應(yīng)用提供了一定依據(jù)。

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