李 光 邱茜茜 賀迎坤 范波勝△

1)焦作煤業(yè)集團中央醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 焦作 454000 2) 河南省人民醫(yī)院神經(jīng)介入科，河南 鄭州 450003

神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)是重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子之一，能促進缺血損傷的神經(jīng)細胞存活、生長[1-2]，對腦缺血有重要的神經(jīng)保護作用[3]，能夠有效改善腦梗死患者的預(yù)后[4-5]。骨髓間充質(zhì)干細胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)是一種存在于骨髓組織中的非造血干細胞，是繼胚胎干細胞和神經(jīng)干細胞之后，又一種在體內(nèi)外均能向神經(jīng)細胞分化的干細胞[6]，并且經(jīng)相關(guān)實驗[7-8]證實BMSCs還容易通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)導(dǎo)入外源性基因，并可以在體內(nèi)長期穩(wěn)定表達，從而成為神經(jīng)系統(tǒng)疾病進行基因治療的理想靶細胞[9]。在本研究中，我們將應(yīng)用NGF基因修飾的BMSCs經(jīng)腦梗死模型大鼠的尾靜脈移植進入其體內(nèi)，以求發(fā)揮NGF和BMSCs兩者的協(xié)同治療作用，為臨床治療腦梗死做出有益的探索。

1 材料和方法

1.1實驗動物及材料相同遺傳背景健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體質(zhì)量280～320 g，由鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。優(yōu)級胎牛血清(Hyclone)，DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司)，G418(Gibco公司)，淋巴細胞分離液及BrdU(Sigma公司)，小鼠抗BrdU單克隆抗體(SANTA CRUZ)，TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(Roche公司)，Trizol試劑以及Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen公司)，總RNA提取試劑盒、RT-PCR擴增試劑盒、凝膠回收試劑盒以及質(zhì)粒提取試劑盒均購自德國QIAGEN公司。

1.2方法

1.2.1 NGF基因修飾的BMSCs的過程及鑒定：重組真核表達質(zhì)粒pIRES-NGF的構(gòu)建；BMSCs的分離擴增、培養(yǎng)及鑒定；質(zhì)粒pIRES-NGF轉(zhuǎn)染BMSCs后的檢測可參考本研究小組既往研究結(jié)果[10-11]。

1.2.2 腦梗死大鼠模型制備及實驗分組：參考改良的包新杰[12]和麥筱莉[13]等制備大鼠腦梗死灌注模型。大鼠在術(shù)前12 h禁食，4 h禁水，腹腔注射水合氯醛麻醉，頸部正中切口，分離結(jié)扎左側(cè)頸外動脈，用眼科剪在左側(cè)頸總動脈剪V型小口，插入頭端燒成圓鈍形的專用尼龍線栓，沿頸內(nèi)動脈向顱內(nèi)插入線栓，進線長度18～19 mm，保留90 min后緩慢將線栓拔出至分叉處，實現(xiàn)大腦中動脈血流再灌注，模型制作完畢。模型成功的標(biāo)志為栓塞對側(cè)肢體偏癱，行走時向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈。將30只符合條件的腦梗死模型大鼠按隨機數(shù)字表法分為3組：Model組、BMSCs移植組和NGF-BMSCs移植組，每組10只。

1.2.3 細胞移植：MCAO術(shù)后24 h，將總體積為1 mL的經(jīng)BrdU標(biāo)記的兩類細胞(細胞密度為3×106個/mL)進行尾靜脈移植，即BMSCs移植組注入BMSCs，NGF-BMSCs移植組注入NGF基因修飾的BMSCs，Model組僅給予1 mLPBS進行尾靜脈注入。

1.2.4 大鼠神經(jīng)功能缺損評分：各組隨機抽取5只大鼠分別于移植后1 d、7 d和14 d進行mNSS評分檢測神經(jīng)功能缺損情況，該評分規(guī)則包括運動、感覺、平衡和反射試驗四個方面，0分為正常，18分為最嚴(yán)重神經(jīng)功能缺失，評分越高提示神經(jīng)功能損害程度越重[14]。

1.2.5 標(biāo)本制作：實驗大鼠在細胞移植后14 d隨機抽取5只麻醉處死，應(yīng)用4%多聚甲醛灌注固定，斷頭取腦，石蠟包埋，供HE染色和免疫組織化學(xué)檢查。

1.2.5.1 病理學(xué)觀察：進行HE染色，顯微鏡下觀察比較各組腦組織病理學(xué)變化，拍照。

1.2.5.2 免疫組織化學(xué)檢查：根據(jù)HE染色確定梗死區(qū)域，取相鄰腦組織切片進行TUNEL原位檢測腦組織中神經(jīng)細胞凋亡的情況，結(jié)果判定：TUNEL染色陽性細胞為細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，在顯微鏡下隨機計數(shù)5個高倍視野(400倍)下陽性細胞數(shù)，取其平均數(shù)，對每1個蠟塊，由5張切片獲得一個平均值。

1.2.5.3 免疫熒光組織化學(xué)觀察：觀察經(jīng)BrdU標(biāo)記的植入細胞在腦梗死周邊區(qū)域存活情況，結(jié)果判定：Brdu陽性細胞為細胞核呈綠色熒光，計數(shù)方法同上。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠mNSS神經(jīng)功能評分在移植后1 d比較3組大鼠mNSS評分無顯著性差異(P>0.05)；在移植后7 d和14 d觀察，3組大鼠神經(jīng)功能均有不同程度改善，但差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中NGF-BMSCs移植組mNSS改善好于BMSCs移植組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；BMSCs移植組mNSS改善好于Model組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組實驗大鼠各時間點mNSS評分

注：與 Model組比較，aP<0.05；與BMSCs移植組比較，bP<0.05

2.2 3組大鼠腦組織病理學(xué)比較結(jié)果移植后14 d，3組腦組織切片HE染色顯示：均可見梗死區(qū)域神經(jīng)元缺失，腦組織破壞、溶解，形成壞死空腔，梗死周邊區(qū)域可見細胞核固縮、裂解，膠質(zhì)細胞增生，也可見微血管增生，但是在BMSCs移植組，尤其是NGF-BMSCs移植組神經(jīng)細胞的損傷及丟失相對較輕，并且膠質(zhì)細胞增生較少，微血管增生明顯，缺血性病理改變減輕。見圖1。

圖1 3組大鼠細胞移植后14 d腦組織HE染色(×200) A：Model組；B：BMSCs組；C：NGF-BMSCs組

2.3 BrdU免疫熒光組化檢測植入細胞的存活狀況在移植后14 d，移植細胞的2組均可觀察到Brdu標(biāo)記的陽性細胞，為細胞核呈綠色熒光，主要位于梗死周邊區(qū)域(圖2)。2組計數(shù)進行組間比較結(jié)果顯示(表2)，NGF-BMSCs組梗死周邊陽性細胞數(shù)量最多，與BMSCs移植組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 2組植入細胞BrdU免疫熒光標(biāo)記(×400) A：BMSCs組；B：NGF-BMSCs組

表2 各細胞移植組梗死周邊Brdu陽性細胞數(shù)量

注：2組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)

2.4 TUNEL法原位檢測細胞凋亡結(jié)果移植后14 d，3組梗死周邊區(qū)域均可見核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒的凋亡細胞，凋亡細胞核膜結(jié)構(gòu)完整，核內(nèi)染色質(zhì)濃聚，染色質(zhì)邊集于核周(圖3)，計數(shù)各組凋亡細胞數(shù)目(表3)。結(jié)果顯示，與Model組相比，BMSCs移植組和NGF-BMSCs移植組凋亡細胞數(shù)目明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，同時，NGF-BMSCs移植組凋亡細胞數(shù)目又明顯少于BMSCs移植組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 3組大鼠行TUNEL法原位標(biāo)記凋亡細胞(×200) A：Model組；B：BMSCs組；C：NGF-BMSCs組

表3 3組凋亡細胞數(shù)目比較

注：3組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)

3 討論

目前，隨著高血壓和糖尿病等慢性疾病的發(fā)病率不斷增高，腦梗死的發(fā)病率也不斷提高，近年來針對急性腦梗死的治療已取得了許多進展，尤其是急診靜脈溶栓和神經(jīng)介入取栓術(shù)的廣泛推廣，對于在時間窗內(nèi)就診的急性腦梗死患者具有明顯的治療效果，但對于大多數(shù)錯過時間窗的急性腦梗死患者的治療仍是神經(jīng)學(xué)界面臨的重要難題之一，究其原因是由于腦內(nèi)的神經(jīng)細胞一旦發(fā)生了缺血壞死將很難修復(fù)，就會造成相應(yīng)的神經(jīng)功能障礙，導(dǎo)致患者發(fā)生較高的致殘和致死率，給個人、家庭和社會帶來了重大損失。

BMSCs是一種存在于骨髓組織中的非造血干細胞，屬于多能干細胞[15]，具有較高的端粒酶活性，能自我更新并可以在體內(nèi)外分化為內(nèi)、中、外3個胚層來源組織的細胞，如骨、心肌、肝、腎、神經(jīng)等多種成熟細胞，是繼胚胎干細胞和神經(jīng)干細胞之后，又一種在體內(nèi)外均能向神經(jīng)細胞分化的干細胞[16]。相關(guān)實驗[17-19]證實，BMSCs移植治療腦血管病有一定的治療效果，但是由于其在腦內(nèi)存活時間較短，分化為類神經(jīng)元樣細胞較少，導(dǎo)致治療效果有限[20]。

近年來，隨著基因修飾技術(shù)的不斷發(fā)展，業(yè)已證實[21]附壁生長的BMSCs通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)易導(dǎo)入外源性基因，并可以在體內(nèi)長期高效表達，因此BMSCs逐漸成為神經(jīng)系統(tǒng)疾病基因治療的理想靶細胞，可以設(shè)想將各種神經(jīng)營養(yǎng)因子基因修飾的載體細胞移植入腦內(nèi)，像“微生物泵”源源不斷地分泌各種神經(jīng)營養(yǎng)因子，發(fā)揮其生物學(xué)作用，同時還可以促進BMSCs在腦內(nèi)的存活和分化。目前，研究人員利用各種神經(jīng)營養(yǎng)因子基因修飾的BMSCs移植治療腦部疾病[22]，尤其是腦梗死已取得了較好的治療效果[23-24]，為基因治療腦梗死提供了新的策略和途徑。國內(nèi)的卞合濤等[25]應(yīng)用神經(jīng)營養(yǎng)因子-3基因修飾的BMSCs移植治療腦梗死大鼠，結(jié)果顯示較單純的BMSCs移植能夠進一步降低腦梗死大鼠的mNSS評分，從而改善其神經(jīng)功能障礙，并且經(jīng)TCC染色證實減少了梗死體積，取得了較滿意的治療效果；還有李金艷等[26]應(yīng)用促紅細胞生成素修飾的BMSCs大鼠尾靜脈移植治療腦梗死，實驗證實較單純BMSCs其可促進移植的BMSCs在腦內(nèi)缺血損傷的部位存活，減輕腦細胞凋亡，從而促進腦梗死大鼠的神經(jīng)功能障礙得到改善。另外，宋艷玲等[27]應(yīng)用攜帶VEGF基因的BMSCs移植入MCAO模型大鼠，發(fā)現(xiàn)可以促進缺血腦組織新生血管的形成和上調(diào)缺血周邊區(qū)域Ang-2、CD34的表達水平，使得腦梗死大鼠的神經(jīng)功能障礙也得到減輕。這些實驗顯示應(yīng)用各種神經(jīng)營養(yǎng)因子基因修飾的BMSCs治療腦梗死已成為近年來研究的熱點。

NGF是在1952年先由Levi-Montalcini在鼠肉瘤中發(fā)現(xiàn)，后來Cohen又從鼠頜下腺中純化了NGF，它的發(fā)現(xiàn)和研究開拓了神經(jīng)科學(xué)一個嶄新的研究領(lǐng)域，由此這兩位科學(xué)家被授予了1986年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎[28]。NGF是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中的重要成員之一，是促進神經(jīng)細胞生長和修復(fù)必需的活性物質(zhì)之一，并且在神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和內(nèi)分泌等系統(tǒng)的相互關(guān)系中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[29]，還可以促進神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元的分化[30]。

在本研究中，我們設(shè)計應(yīng)用NGF基因修飾的BMSCs通過大鼠尾靜脈移植進入MCAO模型大鼠體內(nèi)，結(jié)果表明NGF-BMSCs組較單純BMSCs組的mNSS評分進一步下降(P<0.05)，促進了腦梗死模型大鼠的神經(jīng)功能障礙的恢復(fù)，并且經(jīng)病理組織切片證實NGF-BMSCs組較單純BMSCs組腦組織損傷及細胞丟失減輕，通過免疫熒光組織化學(xué)還證實NGF基因修飾的BMSCs能夠促進植入的BMSCs在腦內(nèi)存活和減輕細胞凋亡，取得了較滿意的治療效果，為基因治療腦梗死做出了有益的探索。

[1] 孫迪迪.鼠神經(jīng)生長因子治療腦梗死臨床分析[J].中國實用神經(jīng)疾病雜志，2016，19(18)：119-120.

[2] 謝九冰，楊杉杉，劉若屏，等.神經(jīng)生長因子對原發(fā)性閉角型青光眼的視神經(jīng)保護作用[J].廣東醫(yī)學(xué)，2017，38(21)：3 266-3 269.

[3] 李揚，陳曉迪，李愛麗.神經(jīng)生長因子與腦梗死的相關(guān)性分析[J].中國實驗診斷學(xué)，2016，20(10)：1 792-1 79；1 795.

[4] 姜忠梅，盧冬喜，李紅霞.鼠神經(jīng)生長因子輔助治療急性腦梗死療效觀察[J].山東醫(yī)藥，2015，55(34)：106-107.

[5] 黃彥澤，許敬奇.神經(jīng)生長因子對腦梗死偏癱患者神經(jīng)及運動功能的作用[J].廣東醫(yī)學(xué)，2016，37(z1)：235-236.

[6] 張廣宇，賈延劼，王軍，等.氯化鋰通過調(diào)節(jié)自噬通路促進大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)細胞分化[J].中國病理生理雜志，2017，33(12)：2 128-2 133.

[7] 朱敏，徐運，張躍，等.慢病毒介導(dǎo)的EphrinB2 基因轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞表達的實驗研究[J].中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2017，34(6)：508-511.

[8] 李雅婧，諸葛福艷，梁娟，等.表達hCD4和hCCR5基因的骨髓間充質(zhì)干細胞模型的建立[J].重慶醫(yī)學(xué)，2017，46(32)：4 465-4 468；4 472.

[9] 孫立國，李宏國，范宏斌.骨髓間充質(zhì)干細胞基因轉(zhuǎn)染應(yīng)用的研究進展[J].中國矯形外科雜志，2014，22(1)：36-39.

[10] 范波勝，婁季宇，白宏英.重組雙基因表達質(zhì)粒pIRES-NGF-VEGF165轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs及表達鑒定[J].中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2012，29(12)：1 077-1 079.

[11] 范波勝，婁季宇，白宏英.神經(jīng)生長因子與血管內(nèi)皮生長因子165雙基因共表達載體的構(gòu)建及鑒定[J].中華老年心腦血管病雜志，2013，15(4)：427-429.

[12] 包新杰，李雪元，左賦興，等.穩(wěn)定的大鼠大腦中動脈栓塞腦梗死模型的建立[J].中國實驗動物學(xué)報，2016，24(4)：395-398.

[13] 麥筱莉，韓冰，范海健，等.小鼠缺血性腦梗死模型的制作及7TMR成像的實驗研究[J].醫(yī)學(xué)影像學(xué)雜志，2012，22(10)：1 755-1 758.

[14] 孫晶晶，宋乃光，張耀龍，等.人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶基因修飾骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療腦梗死[J].中國組織工程研究，2015，19(41)：6 665-6 670.

[15] DELORME B，CHATEAUVIEUX S，CHARBORD P.The concept of esenchymalstem cells[J].Regen Med，2006，1(4)：497-509.

[16] 杜佳蕾，張曦元，萬娜，等.體外誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)干細胞分化的研究進展[J].中西醫(yī)結(jié)合心血管病雜志(電子版)，2017，5(27)：32-33.

[17] 張曉英，曲志玲.干細胞移植治療腦血管病的臨床研究[J].中國實用神經(jīng)疾病雜志，2008，11(1)：56-57.

[18] 程率芳.骨髓間充質(zhì)干細胞移植腦梗死大鼠：神經(jīng)功能恢復(fù)與突觸素的表達[J].中國組織工程研究，2016，20(28)：4 182-4 188.

[19] 黃愛華，張萍萍，張斌，等.人胚胎骨髓間充質(zhì)干細胞和單個核細胞靜脈移植治療大鼠腦梗死療效的比較[J].中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報，2016，38(5)：497-506.

[20] 趙仁超，顧建娟，黃敏，等.骨髓間充質(zhì)干細胞靜脈移植治療大鼠腦梗死的機制研究[J].神經(jīng)疾病與精神衛(wèi)生，2016，16(6)：654-658；封3頁.

[21] CHEN X，LIN X，ZHAO J，et al.A tumor-selective biotherapy with prolonged impact on established metastases based on cytokine gene-engineered MSCs[J].Mol Ther，2008，16(4)：749-756.

[22] 許玲，邢衢，馬珊珊，等.HDAC1基因沉默的hUC-MSCs移植對創(chuàng)傷性腦損傷小鼠的神經(jīng)保護作用[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2017，52(6)：697-701.

[23] 劉凱，姜云霞，鄧文帥，等.血管生成素-1基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細胞移植對腦梗死大鼠行為學(xué)的影響[J].山東醫(yī)藥，2015，55(40)：4-7.

[24] 周國慶，金怡，張鵬.沉默RhoA基因?qū)撬栝g充質(zhì)干細胞靜脈移植治療腦梗死大鼠的作用[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2010，14(45)：8 416-8 420.

[25] 卞合濤，郝樓，黃衛(wèi).NT-3基因修飾骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療腦梗死及其機制研究[J].中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2017，16(9)：906-910.

[26] 李金艷，王亮.促紅細胞生成素基因修飾骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療大鼠腦梗死[J].中國組織工程研究，2014，18(23)：3 664-3 669.

[27] 宋艷玲，賴天寶，李嫚.VEGF基因修飾MSCs移植對腦梗死大鼠血管源性機制的實驗研究[J].卒中與神經(jīng)疾病，2011，18(6)：323-325.

[28] 郭曉強，向晉濤.蒙塔爾奇尼：神經(jīng)生長因子的發(fā)現(xiàn)者[J].中國心臟起搏與心電生理雜志，2014，28(2)：177.

[29] 趙英華，劉曉昌，高樂，等.神經(jīng)生長因子修飾的間充質(zhì)干細胞促進兔下頜骨牽張成骨時下牙槽神經(jīng)損傷修復(fù)的實驗研究[J].創(chuàng)傷外科雜志，2016，18(3)：168-171.

[30] 蘇立寧，宋小青，魏會平，等.神經(jīng)生長因子誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)細胞分化的效果觀察及相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)分析[J].山東醫(yī)藥，2016，56(39)：33-35.