臧亞丹

【摘要】本實(shí)驗(yàn)研究中，我們把研究的對(duì)象設(shè)定為人結(jié)腸癌LOVO細(xì)胞，分別從細(xì)胞水平與動(dòng)物水平討論了羅格列酮對(duì)5-氟尿嘧啶的作用機(jī)制以及化療增敏效果。實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果均表明，人結(jié)腸癌LOVO細(xì)胞的生長(zhǎng)由于羅格列酮對(duì)5-氟尿嘧啶的作用受到了很大的抑制作用，細(xì)胞S期周期阻滯和細(xì)胞凋亡正是受到了這種抑制作用的影響被加速了。此研究結(jié)果可為臨床抗腫瘤藥物的開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

【關(guān)鍵字】過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ；羅格列酮，結(jié)腸癌LOVO細(xì)胞；5-氟尿嘧啶

【中圖分類號(hào)】R735.3+5 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】ISSN.2095-6681.2018.4..02

惡性腫瘤中比較常見(jiàn)的一種是結(jié)腸癌，他的發(fā)病率在這些年里逐漸上升。目前結(jié)腸癌的治療方法是以手術(shù)為主輔助結(jié)合化療進(jìn)行綜合治療。5-氟尿嘧啶5-F是結(jié)腸癌化療方案的主要藥物組成，如果5-氟尿嘧啶的用藥量過(guò)少會(huì)無(wú)法達(dá)到正常的效果，用藥量過(guò)多會(huì)使得胃腸道正常細(xì)胞與骨髓細(xì)胞的毒性增加。單獨(dú)使用5-氟尿嘧啶的利用率僅有10%～30%。為了減少他的毒性，5-氟尿嘧啶會(huì)和其他化療增敏劑等的要求一起使用。PPARγ激動(dòng)劑羅格列酮是PPARγ的合成配體，和PPARγ很容易結(jié)合。本次實(shí)驗(yàn)研究里我們的研究對(duì)象為人結(jié)腸癌LOVO細(xì)胞，從細(xì)胞水平和動(dòng)物水平分析羅格列酮對(duì)5-氟尿嘧啶的化療增敏效果及其作用機(jī)制。

本論文實(shí)驗(yàn)包括如下幾個(gè)階段。

1 實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備階段

（1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：裸小鼠，雌性，5周齡左右，體質(zhì)量20g左右，SPF級(jí)條件下飼養(yǎng)。

（2）細(xì)胞株：人結(jié)腸癌LOVO細(xì)胞株，在5% CO2、37℃ 環(huán)境下，在含有100 U/mL盤尼西林Penicillin、100 U/mL鏈霉素streptomycin、10%新生牛血清的Dulbecco's Modified Wagle Medium高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)結(jié)腸癌細(xì)胞。挑選出對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段

（1）荷瘤裸小鼠模型：腫瘤細(xì)胞移植的部位選在裸小鼠的后背右側(cè)皮下。用生理鹽水洗滌對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的LOVO細(xì)胞，通過(guò)生理鹽水重懸計(jì)數(shù)的辦法，接種數(shù)量為5×106/只的LOVO細(xì)胞。

（2）實(shí)驗(yàn)分組：腫瘤細(xì)胞移植14天后，隨機(jī)把荷瘤裸小鼠五只為一組，分成四組。分別是對(duì)照組、羅格列酮組、5-氟尿嘧啶組、和5-氟尿嘧啶&羅格列酮聯(lián)合用藥組。4組分別用純生理鹽水、5-氟尿嘧啶配制的生理鹽水、羅格列酮配制的生理鹽水、5-氟尿嘧啶和羅格列酮共同配制的生理鹽水灌胃給藥，連續(xù)14天。

（3）瘤體測(cè)量、體質(zhì)量和數(shù)據(jù)處理：測(cè)定荷瘤裸小鼠瘤體最短徑和最長(zhǎng)徑，并稱量體質(zhì)量，計(jì)算腫瘤體積，并計(jì)算抑瘤率。給藥14天后把裸小鼠處死，取瘤塊并稱瘤質(zhì)量。

3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)階段

（1）四甲基偶氮唑鹽法測(cè)定細(xì)胞增殖情況：在96孔培養(yǎng)板上接種對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞。在5% CO2、37℃孵育，考慮到分組的要求，各組采取不同處理因素，每一組設(shè)置五個(gè)復(fù)孔進(jìn)行培養(yǎng)16～48小時(shí)，每孔加入20 μL濃度為5 mg/mL即0.5%四甲基偶氮唑鹽，繼續(xù)培養(yǎng)四小時(shí)后離心去除上清，每個(gè)孔加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩，等到甲臜完全溶解以后，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在波長(zhǎng)490 nm處用酶標(biāo)儀讀取OD值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

（2）細(xì)胞形態(tài)觀察：在6孔培養(yǎng)板上接種取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的LOVO細(xì)胞，在細(xì)胞作用不同處理因素四十八小時(shí)，然后于熒光倒置顯微鏡下進(jìn)行查看、攝片。

（3）染色并檢測(cè)細(xì)胞核形態(tài)：用Hoechst 33342對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞標(biāo)記，每孔加入熒光染料Hoechst 33342 1mL，在37℃下避光熒光染色20 min，染色充分后在熒光顯微鏡下進(jìn)行查看、攝片。

（4）細(xì)胞周期分布檢測(cè)：結(jié)腸癌細(xì)胞經(jīng)5-氟尿嘧啶、羅格列酮及5-氟尿嘧啶&羅格列酮聯(lián)合處理四十八小時(shí)后，把細(xì)胞收集起來(lái)，并用磷酸緩沖鹽溶液進(jìn)行洗滌，沉淀用事先冷卻的濃度為70%的乙醇固定足夠的時(shí)間。

（5）蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白、周期蛋白依賴性激酶2和細(xì)胞周期蛋白A1的表達(dá)：結(jié)腸癌細(xì)胞經(jīng)羅格列酮或/和5-氟尿嘧啶處理四十八小時(shí)。RIPA裂解液（RIPA Lysis Buffer）是細(xì)胞組織快速裂解液，用它把蛋白提取出來(lái)，使用BCA蛋白濃度檢測(cè)法對(duì)提取出的蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定，使用12%分離膠將等量樣品電泳分離，把蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上，按步驟進(jìn)行三次如下實(shí)驗(yàn)：封閉、一抗孵育、洗膜、二抗孵育、洗膜、顯影。

（6）統(tǒng)計(jì)分析：數(shù)據(jù)分析使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件（SPSS Inc，Chicago，IL，USA），進(jìn)行方差分析及組間比較，當(dāng)P<0.05可以認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的顯著差異。

實(shí)驗(yàn)表明，羅格列酮能夠增強(qiáng)5-氟尿嘧啶對(duì)人結(jié)腸癌結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，這種作用與其促進(jìn)細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞S期周期阻滯有關(guān)，本研究可為臨床上抗腫瘤藥物的研發(fā)提供了理論依據(jù)。

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本文編輯：李 豆