盛雪英　李　嫻, 　李孟婷　張人義　鄧　雙　常冠軍　葉　旭,

(1. 西南科技大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院　四川綿陽(yáng)　621010；2. 四川省非金屬?gòu)?fù)合與功能材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地　四川綿陽(yáng)　621010)

透明質(zhì)酸(HA)和羧甲基纖維素(CMC)基天然高分子生物醫(yī)用水凝膠具有無(wú)毒、可生物降解、良好的生物相容性和低免疫原性等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于組織工程、創(chuàng)傷敷料、藥物釋放、生物傳感器、細(xì)胞封裝等眾多領(lǐng)域[1-5]。文獻(xiàn)[6]通過(guò)氧化羧甲基纖維素(OCMC)與琥珀酸酐改性殼聚糖(NSC)原位交聯(lián)制備了可注射OCMC/NSC水凝膠，研究了羧甲基纖維素氧化率對(duì)水凝膠藥物釋放行為的影響，在可注射藥物傳輸系統(tǒng)中用于蛋白藥物的持續(xù)釋放。文獻(xiàn)[7]通過(guò)己二酸二酰肼改性透明質(zhì)酸(HAX)與聚磷酸鹽(PolyP)交聯(lián)制備了具有生物活性的HAX-PolyP水凝膠，該水凝膠可作為可注射活性支架在臨床上應(yīng)用于骨移植和骨再生。

席夫堿反應(yīng)具有反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)迅速、操作簡(jiǎn)便、不需要外加催化劑和引發(fā)劑等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)席夫堿可與其它可逆共價(jià)鍵或超分子相互作用形成自組裝水凝膠，已成為制備化學(xué)交聯(lián)水凝膠的重要手段[8-9]。由于亞胺鍵易水解，導(dǎo)致許多由改性天然高分子與氨基化合物通過(guò)席夫堿反應(yīng)制備的水凝膠穩(wěn)定性較差、藥物釋放速度較快，限制了其應(yīng)用[10-11]。聚丙烯酰肼(PAH)含有大量酰肼基團(tuán)，常被用作交聯(lián)劑制備環(huán)氧樹(shù)脂、水凝膠、藥物傳輸基質(zhì)、傳感器等[12-15]。本文用高碘酸鈉對(duì)HA和CMC進(jìn)行部分開(kāi)環(huán)氧化，分別制備了oxi-HA和oxi-CMC，同時(shí)制備了具有多酰肼基團(tuán)交聯(lián)位點(diǎn)的高分子交聯(lián)劑PAH，通過(guò)席夫堿反應(yīng)，化學(xué)交聯(lián)制備了系列oxi-HA/oxi-CMC/PAH水凝膠，并對(duì)其微觀形貌、溶脹率、降解行為、流變學(xué)性能以及藥物模型BSA的體外釋放行為進(jìn)行了研究。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1　試劑與儀器

羧甲基纖維素鈉(CMC，800～1 200 mPa·s)，高碘酸鈉、牛血清蛋白(BSA)、考馬斯亮藍(lán)G250，AR，上海阿拉丁生物化學(xué)科技股份有限公司；透明質(zhì)酸鈉(HA，190 kDa)，AR，山東銀河生物科技有限公司；丙烯酸甲酯(ω,98%)、水合肼(ω,≥80%)、亞硫酸氫鈉(ω,99%)、溴酸鉀(ω,99%)、四丁基溴化銨(ω,98%)，AR，成都市科龍化工試劑廠；磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH值7.4)，實(shí)驗(yàn)室配制。

ULUP-IV-100L型超純水器，四川優(yōu)普超純科技有限公司；FD 5-5型冷凍干燥機(jī)，西盟國(guó)際集團(tuán)；Nicolet-5700型傅里葉變換紅外光譜儀，美國(guó)熱電儀器公司；Bruker Avance 600型核磁共振波譜儀，瑞士布魯克公司；Wyatt DAWN HELEOSⅡ 型十八角度激光光散射儀，美國(guó)懷雅特公司；Agilent 1200型高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫公司；HAAKE RheoStress 600型流變儀，賽默飛世爾科技有限公司；TM-1000型掃描電子顯微鏡，日本日立公司；UV752N型UV-vis分光光度計(jì)，上海佑科儀器設(shè)備有限公司。

1.2　水凝膠的制備

1.2.1oxi-HA及oxi-CMC的制備

以高碘酸鈉為氧化劑，對(duì)HA和CMC部分開(kāi)環(huán)氧化，分別制備oxi-HA和oxi-CMC[16-17]。稱取6.0 g HA溶解于600 mL蒸餾水中，緩慢加入100 mL 0.15 mol·L-1的高碘酸鈉水溶液，室溫避光反應(yīng)24 h。加入過(guò)量乙二醇終止反應(yīng)，用截留分子量(MWCO)為8～14 kDa的普通干型透析袋超純水透析，冷凍干燥，得到oxi-HA。采用堿消耗法[18]測(cè)定oxi-HA雙醛基的含量，HA的氧化率約為58%。采取相同方法，將6.0 g CMC溶解于600 mL蒸餾水中，緩慢加入100 mL 0.12 mol·L-1的高碘酸鈉水溶液氧化改性，制得oxi-CMC，并測(cè)定其雙醛基的含量，CMC的氧化率約為43%。

1.2.2PAH的制備

1.2.3oxi-HA/oxi-CMC/PAH水凝膠的制備

將8.00 g氯化鈉、0.20 g氯化鉀、1.44 g磷酸氫二鈉和0.24 g磷酸二氫鉀溶解于超純水中，控制pH值為7.4，定容至1 L，得到pH值7.4的PBS溶液。以PBS溶液為溶劑，分別配制0.06，0.08，0.10 g/mL的oxi-HA溶液和oxi-CMC溶液以及0.01,0.02,0.03 g/mL的PAH溶液。在37 ℃條件下，將0.1 mL oxi-HA溶液、0.1 mL oxi-CMC溶液和0.185 mL PAH溶液混合均勻，制備系列oxi-HA/oxi-CMC/PAH水凝膠。

1.3　水凝膠的溶脹行為和降解動(dòng)力學(xué)研究

將凍干水凝膠樣品(w0)浸泡在37 ℃的PBS溶液中，在不同時(shí)間點(diǎn)取出樣品，用潤(rùn)濕濾紙吸干表面水分并稱重(ws)，計(jì)算水凝膠的溶脹率SR=(ws-w0)/w0。與溶脹率測(cè)定方法相似，將凍干水凝膠樣品(w0)浸泡在37 ℃的PBS溶液中，在設(shè)定時(shí)間點(diǎn)取出樣品，冷凍干燥后稱重(wd)，計(jì)算水凝膠的降解百分?jǐn)?shù)PD=(w0-wd)/w0×100%。式中w0為水凝膠樣品的初始干重，ws為不同時(shí)間點(diǎn)水凝膠樣品的濕重，wd為不同設(shè)定時(shí)間點(diǎn)水凝膠樣品的干重。平行測(cè)定3次。

1.4　水凝膠的流變學(xué)性能研究

在振動(dòng)模式下用HAAKE RheoStress 600型流變儀(轉(zhuǎn)子直徑20 mm，板間距1 mm)研究37 ℃時(shí)水凝膠的流變學(xué)性能。將水凝膠樣品置于流變儀平板上15 min，設(shè)置流變應(yīng)力為10 Pa，角頻率(ω)范圍為1～100 rad·s-1，在動(dòng)態(tài)頻率掃描模式下測(cè)定水凝膠的儲(chǔ)能模量(G' )和損耗模量(G'' )，評(píng)價(jià)水凝膠的黏彈性。將水凝膠樣品置于流變儀平板上30 min，設(shè)置流變頻率為1 Hz，在應(yīng)力掃描模式下測(cè)定G' 和G'' 隨剪切應(yīng)力(τ)的變化，評(píng)價(jià)水凝膠的力學(xué)強(qiáng)度。

1.5　凍干水凝膠的微觀形貌表征

將凍干oxi-HA6/oxi-CMC6/PAH3水凝膠用液氮脆斷，斷面噴金后，用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察斷面的微觀形貌。

1.6　水凝膠的體外藥物控釋性能研究

以PBS溶液為介質(zhì)，在37 ℃下測(cè)定不同時(shí)刻載藥水凝膠中藥物模型BSA的累積釋放百分?jǐn)?shù)，研究水凝膠的體外藥物控釋性能。采用考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)[19]測(cè)定BSA的濃度。

2）交互功能。利用微信的聊天功能，可以設(shè)立多個(gè)微信圈，微信群是一個(gè)即時(shí)的交流平臺(tái)，在群中可以發(fā)文字、視頻和音頻，實(shí)現(xiàn)良好的交流效果。微信圈創(chuàng)建簡(jiǎn)單，可以設(shè)立學(xué)生群，師生群，學(xué)習(xí)互助群等，微信群交流方便，可實(shí)現(xiàn)語(yǔ)音交流和視頻交流，學(xué)生可以針對(duì)學(xué)習(xí)的疑惑隨時(shí)向同學(xué)和老師求助，教師和同學(xué)也可隨時(shí)進(jìn)行回答，是釋疑解惑的絕佳平臺(tái)。

將100 mg考馬斯亮藍(lán)G250用50 mL 95%(ω)的乙醇溶解后，加入100 mL 85%(ω)的磷酸，用超純水定容至1 L，過(guò)濾，得到考馬斯亮藍(lán)G250溶液。準(zhǔn)確配制0～1.0 mg·mL-1BSA標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，取標(biāo)準(zhǔn)系列溶液0.1 mL置于試管中，分別加入5 mL 0.1 mg·mL-1考馬斯亮藍(lán)G250溶液，混合均勻。以0.1 mL PBS溶液與5 mL考馬斯亮藍(lán)G250溶液的混合物作參比，用UV-vis分光光度計(jì)測(cè)定溶液在595 nm處的吸光度A。結(jié)果表明，在0～0.020 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)，溶液吸光度A與BSA濃度c(mg·mL-1)具有良好的線性關(guān)系：A=34.205c+ 0.0517(R2=0.9991)。

將35 mg BSA溶于3 mL 0.03 g/mL的PAH溶液中，移取該溶液0.185 mL，加入到0.10 mL 0.06 g/mL的oxi-HA和0.10 mL 0.06 g/mL的oxi-CMC的混合液中，制備oxi-HA6/oxi-CMC6/PAH3載藥水凝膠，冷凍干燥。將凍干載藥水凝膠樣品置于5 mL 37 ℃的PBS溶液中，在設(shè)定時(shí)間點(diǎn)取出0.1 mL釋放液(同時(shí)向釋放體系加入0.1 mL PBS溶液，確保介質(zhì)總體積始終保持5 mL)，測(cè)定t時(shí)刻釋放液中BSA的濃度ct，計(jì)算t時(shí)刻BSA的累積釋放量Mt=ct×5+∑ct-1×0.1和累積釋放百分?jǐn)?shù)Mt/M0×100%(M0為水凝膠樣品中BSA的初始負(fù)載量)。

2　結(jié)果與討論

2.1　結(jié)構(gòu)表征

圖1　oxi-CMC,oxi-HA和凍干oxi-HA/oxi-CMC/PAH水凝膠的FT-IR圖Fig.1　FT-IR spectra of oxi-CMC, oxi-HA and lyophilized oxi-HA/oxi-CMC/PAH hydrogels

2.2　水凝膠的溶脹及降解行為

由表1和圖2(a)-圖2(c)可知，系列oxi-HA/oxi-CMC/PAH水凝膠在37 ℃ PBS溶液中均能快速溶脹，5 h接近溶脹平衡，溶脹率介于10～19之間。當(dāng)oxi-HA和oxi-CMC濃度一定時(shí)，PAH濃度越高，所提供的化學(xué)交聯(lián)位點(diǎn)(酰肼基團(tuán))越多，形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)越致密，水分子進(jìn)入凝膠內(nèi)部擴(kuò)張三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)越困難，溶脹率越??；當(dāng)PAH濃度一定時(shí)，隨著前驅(qū)體oxi-HA和oxi-CMC濃度的升高，前驅(qū)體提供的醛基越多，同時(shí)分子鏈間相互纏繞越緊密，形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)越致密，溶脹率越小。

表1　oxi-HA/oxi-CMC/PAH水凝膠的溶脹率(5 h)和降解百分?jǐn)?shù)(20 d)Table 1 Swelling ratio (5 h) and degradation percentage (20 d) of oxi-HA/oxi-CMC/PAH hydrogels

從表1可以看出，系列oxi-HA/oxi-CMC/PAH水凝膠在37 ℃ PBS溶液中20 d降解百分?jǐn)?shù)介于50%～96%之間，其中oxi-HA6/oxi-CMC6/PAH3水凝膠的20 d降解百分?jǐn)?shù)最低，為51%左右。由圖2(d)-圖2(f)可知，當(dāng)oxi-HA和oxi-CMC濃度一定時(shí)，PAH濃度越高，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)越致密，降解速度越慢，20 d降解百分?jǐn)?shù)越??；PAH濃度一定時(shí)，交聯(lián)劑所提供的化學(xué)交聯(lián)位點(diǎn)(酰肼基團(tuán))數(shù)量一定，oxi-HA和oxi-CMC濃度越高，水凝膠的親水性越強(qiáng)，水凝膠更容易在PBS溶液中由于溶蝕而失重，表現(xiàn)出更快的降解速度，20 d降解百分?jǐn)?shù)越大。

圖2　oxi-HA/oxi-CMC/PAH水凝膠在37 ℃ PBS溶液中的溶脹率和降解百分?jǐn)?shù)Fig. 2　Swelling ratio and degradation percentage of oxi-HA/oxi-CMC/PAH hydrogels in PBS at 37 ℃

不難看出，oxi-HA6/oxi-CMC6/PAHx(x=1, 2, 3)水凝膠5 h溶脹率介于16～19之間，20 d降解百分?jǐn)?shù)介于50%～72%之間，具有良好的吸水性和較好穩(wěn)定性。

2.3　水凝膠的流變學(xué)性能

由圖3(a)可知，oxi-HA6/oxi-CMC6/PAHx(x=1,2,3)水凝膠的儲(chǔ)能模量G' 明顯大于損耗模量G''，在一定角頻率范圍內(nèi)(ω=1～100 rad·s-1)，G' 和G'' 變化不大，表明水凝膠具有較完整的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和一定的耐剪切性；PAH濃度越高，G' 和G'' 越大，水凝膠黏彈性越好。圖3(b)為oxi-HA6/oxi-CMC6/PAHx(x=1,2,3)水凝膠的抗屈服能力測(cè)試曲線，前驅(qū)體濃度一定時(shí)，PAH濃度越高，水凝膠屈服應(yīng)力值越大，其中oxi-HA6/oxi-CMC6/PAH3水凝膠屈服應(yīng)力值最大，達(dá)到371 Pa。

溶脹、降解行為及流變學(xué)性能研究結(jié)果表明，oxi-HA6/oxi-CMC6/PAH3水凝膠的綜合性能最好。

圖3　oxi-HA6/oxi-CMC6/PAHx(x=1,2,3)水凝膠的G' 和G'' 隨角頻率和剪切應(yīng)力的變化曲線Fig. 3　Plots of G' and G'' versus ω(1-100 rad·s-1) and versus τ of oxi-HA6/oxi-CMC6/PAHx(x=1,2,3) hydrogels

2.4　凍干水凝膠的微觀形貌

凍干oxi-HA6/oxi-CMC6/PAH3水凝膠斷面的微觀形貌如圖4所示，可以看出，水凝膠表現(xiàn)出連續(xù)的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，其平均孔隙直徑為80～200 μm，該結(jié)構(gòu)有利于oxi-HA6/oxi-CMC6/PAH3水凝膠潛在應(yīng)用于藥物傳輸和細(xì)胞封裝等領(lǐng)域。

圖4　oxi-HA6/oxi-CMC6/PAH3水凝膠的SEM圖Fig.4　SEM image of oxi-HA6/oxi-CMC6/PAH3 hydrogel

2.5　水凝膠的體外藥物控釋性能

載藥水凝膠的藥物釋放機(jī)制有擴(kuò)散控制、溶脹控制、降解控制、滲透壓控制、化學(xué)反應(yīng)控制等，物理方式載藥的水凝膠體系，其主要藥物釋放機(jī)制為擴(kuò)散控制、溶脹控制和降解控制等[20-21]。

oxi-HA6/oxi-CMC6/PAH3載藥水凝膠中蛋白藥物模型BSA在37 ℃ PBS溶液中的釋放曲線如圖5所示。在初始階段，BSA釋放較快，表現(xiàn)出一定程度的“突釋”現(xiàn)象，24 h時(shí)累積釋放達(dá)到52%左右，這主要是由于水凝膠在37 ℃的PBS溶液中能夠快速達(dá)到溶脹平衡(5 h左右)，水凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)被快速擴(kuò)張，同時(shí)水凝膠內(nèi)部與外部介質(zhì)間存在較大的BSA濃度梯度，而干凝膠的孔隙尺寸(80～200 μm)遠(yuǎn)大于BSA的流體動(dòng)力學(xué)直徑(7.2 nm)[22]，因此BSA分子可在水凝膠三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中自由擴(kuò)散，并快速擴(kuò)散到外部介質(zhì)中，此階段BSA的釋放主要通過(guò)擴(kuò)散機(jī)制和溶脹機(jī)制控制。

隨著時(shí)間延長(zhǎng)(24 h以后)，BSA釋放速度明顯減緩，這主要是由于在初始階段(24 h以內(nèi))的快速釋放，使載藥水凝膠內(nèi)部與外部介質(zhì)之間的BSA濃度差減小，擴(kuò)散釋放速度明顯減緩，此時(shí)BSA的釋放速度主要決定于BSA的擴(kuò)散速度和水凝膠的降解速度，BSA的釋放由擴(kuò)散機(jī)制和降解機(jī)制共同控制。由圖2(d)可以看出，oxi-HA6/oxi-CMC6/PAH3水凝膠在第7 d的降解百分?jǐn)?shù)為38%左右，而載藥水凝膠中BSA的7 d累積釋放達(dá)到86%左右，因此可以推斷，擴(kuò)散控制在BSA的釋放機(jī)制中仍然占據(jù)十分重要的地位。

綜上所述，在37 ℃ PBS溶液中，oxi-HA6/oxi-CMC6/PAH3載藥水凝膠中藥物模型BSA的釋放通過(guò)擴(kuò)散機(jī)制、溶脹機(jī)制和降解機(jī)制共同控制，表現(xiàn)出較好的藥物控釋能力，可應(yīng)用于蛋白類藥物的短期控釋。

圖5　載藥oxi-HA6/oxi-CMC6/PAH3水凝膠在37 ℃ PBS溶液中BSA的釋放曲線Fig.5　The BSA release profiles from drug-loaded oxi-HA6/oxi-CMC6/PAH3 hydrogel in PBS at 37 ℃

3　結(jié)論

以HA和CMC為原料，通過(guò)高碘酸鈉部分開(kāi)環(huán)氧化，制備了oxi-HA和oxi-CMC；以丙烯酸甲酯為原料，制備了具有多酰肼基團(tuán)交聯(lián)位點(diǎn)的高分子交聯(lián)劑PAH，通過(guò)席夫堿反應(yīng)制備了系列改性天然高分子基水凝膠oxi-HA/oxi-CMC/PAH。結(jié)果表明，在37 ℃ pH值7.4的PBS溶液中，系列水凝膠均能快速溶脹，oxi-HA6/oxi-CMC6/PAH3水凝膠5 h溶脹率達(dá)到16左右；oxi-HA6/oxi-CMC6/PAH3水凝膠的穩(wěn)定性最好，20 d降解率約為51%；載藥oxi-HA6/oxi-CMC6/PAH3水凝膠中BSA的7 d累積釋放率為86%左右，蛋白藥物模型BSA的釋放通過(guò)擴(kuò)散機(jī)制、溶脹機(jī)制和降解機(jī)制控制?；趏xi-HA6/oxi-CMC6/PAH3水凝膠較好的綜合性能，有望應(yīng)用于藥物傳輸和細(xì)胞封裝等領(lǐng)域。

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