楊選鑫，惠　琦，曹高忠，劉建國，杜曉霄，李校堃,4，王曉杰

(1. 溫州醫(yī)科大學藥學院，浙江 溫州　325035；2. 溫州醫(yī)科大學附屬第一人民醫(yī)院藥劑科，浙江 溫州　325000；3. 第二軍醫(yī)大學藥學院，上?！?00433；4. 溫州大學生命科學研究院，浙江 溫州　325035)

糖尿病足部潰瘍(diabetic foot ulcer，DFC)是糖尿病的慢性并發(fā)癥之一，是導致截肢的重要原因，不僅給患者帶來巨大的精神壓力、嚴重地影響生活質(zhì)量，同時也給患者造成了繁重的經(jīng)濟負擔[1-2]。隨著現(xiàn)代生活水平的提高，糖尿病患者逐年增多，因此，迫切需要開發(fā)合適的治療藥物加速糖尿潰瘍創(chuàng)面修復速度、提高愈合質(zhì)量。

酸性成纖維細胞生長因子(acidic fibroblast growth factor，aFGF)具有營養(yǎng)和保護神經(jīng)元、促進損傷修復等功能，可加速損傷愈合[3-6]。課題組所在團隊前期開發(fā)的aFGF一類新藥于2006年經(jīng)FDA批準上市，商品名“艾夫吉夫”，在深Ⅱ度灼傷等急性創(chuàng)面的治療中顯示出明顯促愈合、提高修復質(zhì)量的功效[7]。然而，aFGF應用于糖尿病等慢性潰瘍創(chuàng)面，效果不理想。據(jù)報道，強生公司開展了一項應用aFGF裸質(zhì)粒治療下肢缺血性潰瘍的Ⅲ期臨床試驗，來自30個國家171個醫(yī)院的525個重型肢端缺血潰瘍患者參與的臨床試驗，以沒有統(tǒng)計學差異而告終[8]。aFGF 裸質(zhì)粒Ⅲ期臨床失敗的主要原因與糖尿病等慢性潰瘍創(chuàng)面微環(huán)境改變，造成缺血區(qū)aFGF 基因轉(zhuǎn)錄表達能力下降，aFGF很快被細胞外環(huán)境蛋白酶降解有關。在糖尿病等慢性潰瘍創(chuàng)面，高糖或者壓力等外界刺激誘導產(chǎn)生活性氧族(reactive oxygen species，ROS)激活炎癥細胞，產(chǎn)生過量的炎性因子，導致炎癥反應延長，炎性滲出物累積破壞創(chuàng)面微環(huán)境，造成細胞損傷[9]。然而，糖尿病足經(jīng)藥物治療后，附近微環(huán)境改善有助于減少減輕炎癥刺激, 可提高干細胞移植后血管新生[10]。成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞過度凋亡阻礙了肉芽組織生成，影響表皮細胞的移行及上皮化[11]。糖尿病等慢性潰瘍創(chuàng)面，還存在基質(zhì)金屬蛋白酶過量表達，降解多種細胞外基質(zhì)成分，同時糖基化終末產(chǎn)物的堆積使細胞外基質(zhì)、膠原糖基化，阻止創(chuàng)面膠原的正常合成，破壞組織修復細胞的遷移環(huán)境[8]。糖尿病慢性潰瘍創(chuàng)面上述微環(huán)境改變直接影響損傷愈合進程，造成損傷創(chuàng)面的遷延不愈。

水凝膠類工程材料具有誘導組織再生，調(diào)節(jié)細胞生長、分化，且無排斥反應。生長因子和合適的載體材料組合可以防止蛋白酶水解，有效保護和緩慢釋放生長因子[12]，有望成為治療慢性潰瘍和彌漫性皮膚創(chuàng)傷的新方法?？ú肥潜┧徭I合烯丙基蔗糖或季戊四醇烯丙醚的高分子聚合物，是一類重要的藥物遞送材料[13-14]。本研究前期以卡波姆940為載體，制備加載rh-aFGF的卡波姆940凝膠，本研究以鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導制備SD大鼠糖尿病模型，研究rh-aFGF卡波姆940凝膠對糖尿病SD大鼠全層皮膚切除和燙傷兩種模型的修復作用。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1實驗動物♂ SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g，合格證號：20070000301262，購自上海Sippr-BK實驗動物有限公司。

1.1.2試劑rh-aFGF卡波姆940凝膠由浙江省生物技術(shù)制藥工程重點實驗室提供；STZ購自Sigma公司。

1.1.3儀器手持血糖儀及試紙購自強生公司，YLS-5Q型燙傷儀購自濟南益廷科技發(fā)展有限公司，石蠟包埋機(EG1150H)和石蠟切片機(RM2235)購自Leica公司(德國)，ECLPSE 80i正置顯微鏡購自Nikon公司。

1.1　方法

1.2.11型糖尿病SD大鼠模型和皮膚創(chuàng)傷模型制備及分組所有大鼠實驗均在第二軍醫(yī)大學實驗動物中心(上海市)SPF級動物房完成。用0.1 mol·L-1檸檬酸(pH=4.5)緩沖液配制濃度為70 g·L-1的STZ溶液，按體質(zhì)量1.0 mL·kg-1的劑量對SD大鼠進行尾靜脈注射，每天1次，連續(xù)2 d，每次配制的STZ注射液在30 min內(nèi)注射完畢。自第1次注射72 h后檢查血糖，血糖≥11.1 mmol·L-1為合格模型。符合血糖條件的大鼠隨機編號，用戊巴比妥鈉按照體質(zhì)量45 mg·kg-1進行腹腔注射麻醉，背部用脫毛劑脫毛。全層皮膚切除模型在背部一側(cè)做1個直徑1.8 cm圓形標記，用碘伏消毒皮膚后沿標記線將全層皮膚切除，創(chuàng)面按壓止血；皮膚燙傷模型用YLS5Q型燙傷儀在背部燙出直徑為1.8 cm的深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面，燙傷條件為：燙頭溫度85℃，壓力0.5 kg，時間為10 s。

兩種皮膚損傷模型中的所有大鼠分為對照組(Control組)、賦形劑組(Vehicle組)和rh-aFGF卡波姆940凝膠低、高劑量組(Gel 90 AU組和Gel 270 AU組)，每組8只。對照組每日僅用0.2 mL生理鹽水處理，賦形劑組每日用未加載rh-aFGF卡波姆940凝膠0.2 mL處理，rh-aFGF卡波姆940凝膠低、高劑量組分別以90 AU·cm-2或270 AU·cm-2的劑量進行治療。

1.2.2糖尿病SD大鼠創(chuàng)面治療及愈合速度研究創(chuàng)面形成后當天開始治療，每天給藥1次。治療前用雙氧水、生理鹽水沖洗傷口，并用碘伏消毒創(chuàng)面，然后給予相應藥物，并用棉簽涂抹均勻，連續(xù)治療21 d；每天觀察每只動物傷口愈合情況，在相同條件下于0、7、14、21 d拍攝創(chuàng)面。傷口面積用Image Pro plus 6.0軟件計算，傷口愈合速率以愈合百分比計算，計算公式如下：Pi=(Ao-Ai)·Ao-1，其中Ao為0 d傷口面積；Ai為創(chuàng)傷拍攝當天的面積。

1.2.3HE染色及病理學評分連續(xù)給藥21 d后，每組隨機選擇3只SD大鼠用10%的水合氯醛按體質(zhì)量4.0 mL·kg-1腹膜內(nèi)深度麻醉。將傷口周圍的皮膚組織切下，在預冷4%多聚甲醛中固定過夜，石蠟包埋，切片，蘇木精和伊紅(HE)染色，用于組織病理學評估。使用正置顯微鏡以400的倍數(shù)觀察成纖維細胞、肌成纖維細胞、毛細血管增殖和膠原纖維表達情況。使用半定量評分，無增殖(0分)，輕度增殖(1分)，顯著增殖(2分)，明顯增生(3分)。

1.2.4統(tǒng)計學分析通過GraphPad Prism 5.0軟件進行t檢驗和ANOVA分析進行可量化結(jié)果的統(tǒng)計分析。等級資料用Radit分析。

2　結(jié)果

2.1rh-aFGF卡波姆940凝膠提高糖尿病SD大鼠皮膚創(chuàng)面愈合速度如Fig 1A和Fig 2A所示，所有實驗動物從創(chuàng)面形成當天到治療結(jié)束，傷口表面干燥無滲出，無化膿潰爛現(xiàn)象。rh-aFGF卡波姆940凝膠對1型糖尿病大鼠全層皮膚切除和燙傷模型均有較好的治療效果，從創(chuàng)面形成(0 d)后開始，隨著治療時間的延長，各組傷口面積均逐漸縮小，但縮小程度以治療組最明顯。

全層皮膚切除模型：如Fig 1B所示，經(jīng)21 d治療，對照組的傷口面積為(1.00±0.24)cm2，賦形劑組為(1.08±0.17)cm2，說明賦形劑組對創(chuàng)面愈合無影響，差異無統(tǒng)計學意義。rh-aFGF卡波姆940凝膠低、高劑量組傷口面積縮小分別為(0.72±0.14)cm2和(0.62±0.18)cm2，與對照組比較差異明顯(P<0.01)。如Fig 1C所示，創(chuàng)面面積縮小百分率：對照組平均為(64.6±14.80)%，rh-aFGF卡波姆凝膠低、高劑量組分別是(81.40±5.48)%和(84.20±4.82)%，與對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

Fig 1　Effect of rh-aFGF-carbomer gel on healing rate of full-thickness wound model(n=8)

A:Photographs of wound; B:Area of wound; C:Wound healing rate.*P<0.05,**P<0.01vscontrol

燙傷模型：如Fig 2B所示，空白對照組經(jīng)21 d治療燙傷面積縮小為(0.86±0.19)cm2；rh-aFGF卡波姆940凝膠低、高劑量組燙傷面積縮小分別為(0.63±0.16)cm2和(0.62±0.11)cm2，與對照組比較差異明顯(P<0.05,P<0.01)。如Fig 2C所示，創(chuàng)面面積縮小百分率：對照組為(60.30±7.78)%，而rh-aFGF卡波姆940凝膠劑低、高劑量治療組分別為(72.80±6.89)%和(74.20±4.56)%，與對照組相比差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.2rh-aFGF卡波姆940凝膠提高創(chuàng)傷皮膚病理學評分如Fig 3所示，每組動物在實驗結(jié)束選取3只做皮膚HE病理切片檢查，重點觀察成纖維細胞、肌成纖維細胞細胞、毛細血管和膠原纖維增殖情況，采用半定量化評分。如Fig 3B、3D所示，rh-aFGF卡波姆940凝膠明顯促進兩種皮膚創(chuàng)傷模型的成纖維細胞增殖(P<0.05)。并且從Fig 3D可知，rh-aFGF卡波姆940凝膠能明顯促進燙傷模型膠原纖維生成(P<0.05)。

Fig 2　Effect of rh-aFGF-carbomer gel on healing rate of scalded skin(n=8)

A:Photographs of skin wound; B:Area of wound; C:Wound healing rate.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

3　討論

糖尿病潰瘍創(chuàng)面微環(huán)境改變，導致組織生長因子及其受體表達下調(diào)，是糖尿病潰瘍難愈合的重要原因之一[11]。aFGF在創(chuàng)面愈合中的作用已得到廣泛認可，但是在炎癥因子介導的慢性潰瘍創(chuàng)面，aFGF很容易被細胞外蛋白酶降解而喪失藥理作用[15]，因此，aFGF應用在糖尿病等慢性潰瘍創(chuàng)面其效果受到極大影響。

本研究利用STZ誘導產(chǎn)生1型糖尿病，制備SD大鼠全層皮膚切除和燙傷模型，模擬糖尿病患者急性損傷和慢性損傷的修復過程，研究rh-aFGF卡波姆940凝膠對糖尿病損傷的修復作用。實驗結(jié)果顯示，rh-aFGF卡波姆940凝膠對1型糖尿病SD大鼠全層皮膚切除和燙傷創(chuàng)面有非常明顯的促進愈合作用，創(chuàng)面面積經(jīng)14 d治療后明顯縮小。在全層皮膚切除模型和燙傷模型的增殖評分中，對照組四項指標評分指數(shù)總和分別為16和13，賦形劑組指數(shù)總和分別為14和16，兩者較為接近。rh-aFGF卡波姆凝膠高、低劑量組均顯示較高纖維細胞指數(shù)和新血管指數(shù)，指數(shù)總和均大于23，從病理學評分綜合顯示較好治療效果。有文獻報道，皮膚癤癰潰瘍修復療效與抗菌活性和免疫增強作用可能有關[16]。本研究中，水凝膠rh-aFGF卡波姆940凝膠療效作用可能與改善創(chuàng)面微環(huán)境，提高抑菌能力和降低炎癥反應有關，其療效在全層皮膚切除模型更加明顯。以卡波姆940加載rh-aFGF制備的水凝膠，對水和氣體具有雙向通透性；具有良好屏障功能，有效抵御細菌入侵，防止感染；使創(chuàng)面始終處于濕潤的微環(huán)境中，不僅利于傷口愈合且可浸潤暴露的末梢神經(jīng)；有效吸收傷口分泌物，避免黏連；與皮膚潰瘍面有較好接觸性能；呈透明狀，有利于對傷口愈合情況的觀察。

Fig 3　Results of HE staining of rh-aFGF-carbomer gel on skin wound model(n=3)

A.HE staining in 21 days of full-thickness model(A1:Control、A2:Vehicle;A3：Gel 90AU;A4:Gel 270AU); B.Total pathological evaluation of HE staining of full-thickness model(1:Fibroblast;2:Fibrocyte;3:Capillary Vessel;4:Collagen Fibers); C:HE staining in 21 days of scalded model(C1:Control、C2:Vehicle;C3：Gel 90AU;C4:Gel 270AU); D:Total pathological evaluation of HE staining of full-thickness model(1:Fibroblast;2:Fibrocyte;3:Capillary Vessel;4:Collagen Fibers).*P<0.05vscontrol.

上述實驗結(jié)果提示，rh-aFGF卡波姆940凝膠能明顯促進糖尿病SD大鼠皮膚創(chuàng)傷愈合過程，有望成為一種治療糖尿病潰瘍的新制劑。

(致謝：感謝溫州醫(yī)科大學浙江省生物技術(shù)制藥工程重點實驗室和第二軍醫(yī)大學藥學院及實驗動物中心為本研究提供科研場所。感謝在實驗過程中給予幫助的老師和同學！)

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