焦作市畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測中心 454150

1 引言

硝基呋喃類抗生素是具有5-硝基呋喃基本結(jié)構(gòu)的廣譜抗菌藥物，主要包括呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林和呋喃妥因，能夠有效防治傷寒、副傷寒和家禽原蟲病（如球蟲、組織滴蟲、卡氏白細(xì)胞原蟲等），還對大腸桿菌性敗血癥及呼吸道疾病的繼發(fā)性細(xì)菌感染有一定的防治效果[1]。硝基呋喃類作為獸藥主要用于抗菌消炎，廣泛應(yīng)用于家畜家禽的痢疾、腸炎、球蟲病的預(yù)防和治療[2]，也在動物飼料中作為添加劑使用[3]。硝基呋喃類藥物在動物體內(nèi)代謝迅速，但其代謝物與動物組織蛋白結(jié)合穩(wěn)定存在，具有致畸、致突變和致癌作用。

研究表明，禽肉中硝基呋喃類代謝物含量比其他動物組織中高，因此準(zhǔn)確快速檢測硝基呋喃類代謝物可以增加畜禽產(chǎn)品的質(zhì)量安全。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測硝基呋喃類代謝物具有快速、準(zhǔn)確和靈敏度高的特點(diǎn)，其中前處理中pH值的調(diào)節(jié)較大影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確度，本文重點(diǎn)探討pH值的優(yōu)化條件。

2 材料

（1）儀器與試劑。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（配電噴霧離子源）美國Waters公司W(wǎng)aters ACQUTYTM UPLCXevo TQ-S、天平感量0.01g、渦旋混合器、振蕩器、組織勻漿機(jī)、離心機(jī)、恒溫振蕩水浴搖床、氮吹儀和pH計(jì)。AOZ對照品、內(nèi)標(biāo)AOZ-D4對照品、AMOZ對照品、內(nèi)標(biāo)AMOZ-D5對照品、AHD對照品、內(nèi)標(biāo)AHD-13C3對照品、SEM·HCI對照品、內(nèi)標(biāo) SEM·HCI-[1,2-15N2;13C]對照品、2-硝基苯甲醛、乙酸銨、磷酸三鉀、濃鹽酸、乙酸乙酯、甲醇色譜純、甲酸色譜純、乙腈色譜純。

3 方法步驟

（1）試樣的制備。取適量新鮮或冷凍的空白或供試樣品，混勻。

（2）質(zhì)量控制樣品的制備。取空白試樣，與待測樣品同步處理。取空白試樣2g，添加20ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作液0.1mL與20ng/mL的混合內(nèi)標(biāo)中間工作液0.1mL，制得濃度1.0μg/kg的陽性添加試料，與待測試樣同步處理。

（3）洗滌。稱取供試試料2±0.02g置具塞離心管中，加10mL50%甲醇溶液，渦旋，中速振蕩10分鐘，然后8000r/分鐘離心5分鐘，棄上清液（小心緩慢地將上清液倒掉即可）。向離心管中加入10mL50%甲醇溶液，重復(fù)洗滌一次。按上述洗滌過程用乙醚洗滌2次。

（4）衍生。洗滌后試料加20ng/mL的混合內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)中間液0.1mL、用刻度吸管加入0.2mo1/L鹽酸5mL和0.1mo1/L2-硝基苯甲醛的溶液100uL，渦旋、混勻。（37±1）℃避光水浴震蕩約16小時。

（5）提取。將衍生后的試料在避光條件下自然冷卻至室溫，用1mo1/L磷酸三鉀溶液調(diào)節(jié)pH值至6、7、7.3、7.6、8、9（衍生加入 0.2mo1/L 鹽酸溶液 5mL 的試料需加入1mo1/L磷酸三鉀溶液約0.85mL）。加乙酸乙酯5mL，渦旋、中速振蕩5分鐘，3000r/分鐘離心10分鐘，吸取上清液；用乙酸乙酯5mL重復(fù)提取一次，合井乙酸乙酯層于40℃水浴下氮?dú)獯蹈?。用初始流動相?%乙腈含0.1%甲酸）水溶液1.0mL溶解殘余物（若發(fā)現(xiàn)試樣渾濁，可將試樣轉(zhuǎn)移到1.5mL離心管，2000r/分鐘離心10分鐘），經(jīng)過濾后作為試樣溶液，供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)優(yōu)化了超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法測定雞肉中硝基呋喃類藥物代謝物的方法。樣品經(jīng)洗滌后去除雜質(zhì)，在酸性條件下水解，與加入的2-硝基苯甲醛溶液進(jìn)行衍生化反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物調(diào)pH7.6后經(jīng)乙酸乙酯提取，氮?dú)獯蹈桑?%乙腈含0.1%甲酸水溶液溶解殘余物，用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。四種硝基呋喃代謝物內(nèi)標(biāo)的使用補(bǔ)償了前處理過程對最后定量結(jié)果的影響，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。