鹽度對瘤背石磺血淋巴生理生化指標(biāo)及免疫應(yīng)激指標(biāo)的影響

沈永龍 ，陳威 ，黃金田 ，李強(qiáng) ，張明明

由于瘤背石磺生活于潮間帶地區(qū)，潮汐、降雨以及人類活動等均可導(dǎo)致潮間帶鹽度發(fā)生變化，從而給水生生物產(chǎn)生鹽度脅迫，大量實(shí)驗(yàn)研究表明，鹽度變化對水生動物生長存活、新陳代謝和滲透壓調(diào)節(jié)等具有顯著影響[1]，同時(shí)環(huán)境脅迫對水生生物生理機(jī)能影響首先通過水生動物體內(nèi)血液生化指標(biāo)和免疫指標(biāo)反映出來。有關(guān)環(huán)境鹽度影響水生動物血液生化指標(biāo)和免疫指標(biāo)變化報(bào)道很多，一般認(rèn)為鹽度突變能夠?qū)е录讱游铩Ⅳ~類機(jī)體的免疫力下降。潘魯青等[2]對對蝦、李才文等[3]對日本對蝦的研究表明，鹽度突變使得生物體的血細(xì)胞數(shù)量降低，溶菌酶活性下降。貝類方面，馬洪明等[4]認(rèn)為鹽度突降會使櫛孔扇貝酸性磷酸酶活性升高。王帥等[5]報(bào)道了低鹽脅迫使得中國血蛤非特異性免疫酶活性降低，且長期會抑制某些非特異性免疫因子。因此，可以通過檢測不同鹽度組瘤背石磺血液成分的變化來評價(jià)瘤背石磺的健康狀況、營養(yǎng)狀況以及對環(huán)境鹽度的適應(yīng)狀況[6]。鑒于此，本文通過研究鹽度變化對瘤背石磺血液生化指標(biāo)和免疫指標(biāo)的影響，從而了解瘤背石磺對環(huán)境鹽度變化的適應(yīng)機(jī)制，為進(jìn)一步提高瘤背石磺的基礎(chǔ)理論研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物

試驗(yàn)用瘤背石磺為采自鹽城射陽河口區(qū)灘涂的同一批體質(zhì)健康個(gè)體，經(jīng)過150 mg/L KMnO4水溶液消毒5 min后采用鋪設(shè)底泥、搭置瓦片等模擬自然環(huán)境的方式進(jìn)行溫箱養(yǎng)殖，暫養(yǎng)馴化2 d備用。

1.2 試驗(yàn)飼料

以螺旋藻作為瘤背石磺的飼料，使用前粉碎均過100目篩，充分混合后作為飼料，晾干保存于冰箱中備用。飼喂時(shí)以海泥作為填充物質(zhì)，海泥與螺旋藻粉按照5：1比例拌飼投喂。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

馴化結(jié)束后，選擇個(gè)體均一的健康瘤背石磺1 200 只，濕重為（2.96±1.02）g，隨機(jī)分成 5 組，分別用不同鹽度梯度（5、15、25、35 和 45）的人工海水飼養(yǎng)于特制的防逃養(yǎng)殖箱（70 cm×50 cm×40 cm）中，每組設(shè)置6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)40只。飼養(yǎng)期間所用海泥均為過200目篩絹網(wǎng)的海邊高潮帶表層泥土，將細(xì)海泥分別在不同鹽度梯度的海水中完全浸濕5 min后鋪設(shè)于養(yǎng)殖箱底部，厚約3 cm，然后將鋪有底泥的養(yǎng)殖箱傾斜30°放置，形成斜坡。在每個(gè)箱中噴灑2 L相應(yīng)鹽度梯度的海水，使其在坡底具有一定的積水，每日添加曝氣后的自來水維持積水量和箱內(nèi)濕度，同時(shí)調(diào)節(jié)水體鹽度，從而維持瘤背石磺生存環(huán)境中鹽度的穩(wěn)定。

表1試驗(yàn)飼料配方和營養(yǎng)水平 （%，干物質(zhì)基礎(chǔ)）

試驗(yàn)期間箱內(nèi)氣溫控制為24～26℃、保持箱內(nèi)濕度88%～90%，每天兩次07：00和17：00用海泥與螺旋藻粉（m：M/20：1）拌飼投喂于固定位置的玻璃食臺，投飼率為2%。每次投喂前清潔養(yǎng)殖箱、食臺及瓦片，投喂后1 h清除殘餌并向養(yǎng)殖箱中分別噴灑不同鹽度梯度的海水，維持瘤背石磺體表濕潤和養(yǎng)殖箱內(nèi)的濕度。觀察記錄攝食情況并檢查防逃設(shè)施是否完好。飼養(yǎng)60 d后，從各處理組中隨機(jī)抽取瘤背石磺30只，采集組織樣本測定相關(guān)指標(biāo)，取樣前禁食24 h。

1.4 樣品制備及分析測定

1.4.1 血淋巴生化指標(biāo) 飼養(yǎng)60 d后，禁食24 h。將從每個(gè)箱中隨機(jī)取得的瘤背石磺30只用肝素鈉溶液潤洗后的2 mL一次性注射器抽取血淋巴。采用心臟動脈抽血，取全血置于離心管中（含有少量已烘干的肝素鈉），測定總蛋白（TP，雙縮脲法）和白蛋白（ALB，溴甲酚綠法）含量。然后將全血3 500 r/min離心15 min制得血清，測定血清中甘油三酯（TG，甘油磷酸氧化酶-過氧化物酶法）、膽固醇（CHOL，膽固醇氧化酶-過氧化物酶法）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT，賴氏法）、堿性磷酸酶（ALP，AMP法）及血糖（GLU，葡萄糖氧化酶法）含量。除血糖外，血淋巴生化指標(biāo)均采用美國倍肯公司生產(chǎn)的ABBOTTALOYON 300全自動生化分析儀進(jìn)行分析測定。1.4.2 免疫應(yīng)激指標(biāo) 首先取樣制備瘤背石磺血清(同1.4.1)，然后分別用超氧化物歧化酶(SOD)測試盒(測總)、過氧化氫酶(CAT)測試盒、還原型谷胱甘肽(GSH)測試盒以及丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)分別測定不同鹽度組相應(yīng)招標(biāo)含量。每次測量設(shè)置空白對照管、標(biāo)準(zhǔn)對照管、測定管，分別設(shè)置三個(gè)平行。蛋白定量采用Bradford考馬斯亮藍(lán)法。

SOD活力單位定義為：每1mL血淋巴在1mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對應(yīng)的SOD量為1個(gè)活力單位（U/mL）。CAT活力單位定義為：每1mL血淋巴每1s分解1μmol H2O2的量為一個(gè)活力單位（U/mL）。GSH的比含量定義為：每L血淋巴中GSH的含量（gGSH/L）。MDA的比含量定義為：每1mL血淋巴中MDA的含量（nmol/mL）。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

原始數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2007初步整理后，采用SPSS 16.0中的單因素方差分析（one-way ANOVA）對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并進(jìn)行Duncan氏多重比較。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SE），P＜0.05認(rèn)為差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)，Excel作圖，得到各指標(biāo)值隨鹽度水平變化的柱狀圖，并將血淋巴各個(gè)指標(biāo)數(shù)值與增重率進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽度對瘤背石磺血淋巴生化指標(biāo)的影響

由圖1可以看出，鹽度對瘤背石磺血液生化指標(biāo)的影響差異顯著。首先，從血清蛋白質(zhì)和血液中酶類指標(biāo)看，隨著鹽度的升高，瘤背石磺血清中的總蛋白、白蛋白和球蛋白含量變化趨勢一致，即低鹽度時(shí)隨著鹽度升高呈現(xiàn)下降趨勢，且各組之間差異明顯（P＜0.05），而在鹽度35時(shí)又突然升高，后又下降。同時(shí)，血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和堿性磷酸酶活性隨鹽度的升高變化趨勢稍有差異，但均隨著鹽度的升高呈現(xiàn)下降趨勢。谷丙轉(zhuǎn)氨酶在鹽度小于25時(shí)，各組之間差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但當(dāng)鹽度繼續(xù)升高后，谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性顯著下降，而谷草轉(zhuǎn)氨酶和堿性磷酸酶均在鹽度大于15時(shí)，其活性就顯著降低。其次，從糖類和脂類的代謝產(chǎn)物分析，鹽度對血糖和血脂的影響變化趨勢不同。血液中血糖含量隨著鹽度的升高呈現(xiàn)下降趨勢，且鹽度15、25和35組之間無顯著具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但顯著低于鹽度5組，顯著高于鹽度45組（P＜0.05）。而血脂隨著鹽度的升高有一定的降低，但差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而膽固醇在血清中的含量呈現(xiàn)“波浪式”變化，且鹽度5、25和45組之間差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1瘤背石磺飼養(yǎng)環(huán)境鹽度水平與血液各生化指標(biāo)之間的關(guān)系

續(xù)圖1瘤背石磺飼養(yǎng)環(huán)境鹽度水平與血液各生化指標(biāo)之間的關(guān)系

2.2 鹽度對瘤背石磺免疫應(yīng)激指標(biāo)的影響

本試驗(yàn)研究表明，鹽度對瘤背石磺某些免疫應(yīng)激有顯著影響。從圖2可以看出，過氧化氫酶在鹽度15時(shí)最高，且低鹽度時(shí)活性顯著高于高鹽度（P＜0.05）。SOD與CAT相似，均在高鹽度時(shí)活性高，但不同的是，SOD在鹽度15時(shí)最高，在鹽度5組最低，且顯著高于和低于其他各組（P＜0.05）。MDA含量與GSH相似，在低鹽度時(shí)含量顯著低于高鹽度（P＜0.05）。GSH在隨著鹽度的升高，先降低再升高，但隨著鹽度的升高，其含量升高幅度較大。MDA含量在鹽度25時(shí)最高，其次是鹽度45組，其余三組之間無顯著影響（P＞0.05）。

圖2瘤背石磺飼養(yǎng)環(huán)境鹽度水平與血液各免疫應(yīng)激指標(biāo)之間的關(guān)系

3 討論

3.1 鹽度對瘤背石磺血淋巴生化指標(biāo)的影響

血液生化指標(biāo)能夠反映水生生物健康狀況和生理狀況，可作為判斷生物體是否患病、患病類型和病情輕重的一種簡便依據(jù)，它受內(nèi)外環(huán)境以及營養(yǎng)狀況等多種因素的影響[7-8]。鹽度是與水生生物存活和生長密切相關(guān)的環(huán)境因子之一，其對機(jī)體的影響間接表現(xiàn)為物質(zhì)交換和體內(nèi)能量的流動。在鹽度脅迫環(huán)境中，瘤背石磺必然需要消耗大量的能量——血糖來維持內(nèi)外環(huán)境的水鹽平衡。從本試驗(yàn)可以看出，在鹽度5時(shí)，瘤背石磺血淋巴中血糖濃度最高，顯著高于其他各組，這與洪磊等[9]對許氏平鮋的研究結(jié)論相似，即血糖水平與鹽度脅迫強(qiáng)度呈一定的正相關(guān)性。但不同的是，在高鹽度時(shí)，瘤背石磺血淋巴的血糖濃度較低，這可能是因?yàn)闈B透壓調(diào)節(jié)途徑不同低鹽度刺激誘導(dǎo)與糖異生作用相關(guān)酶活升高增加血糖濃度，而高鹽度誘導(dǎo)產(chǎn)生不同的滲透壓調(diào)節(jié)途徑，同時(shí)也可能是瘤背石磺對于高滲溶液的滲透壓調(diào)節(jié)比低滲溶液更有效的原因。

血脂是血漿中甘油三酯、膽固醇和類脂的總稱，是生命細(xì)胞基礎(chǔ)代謝的必需物質(zhì)。在正常情況下，機(jī)體中甘油三酯含量和膽固醇含量具有相關(guān)性[10]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著鹽度的升高，瘤背石磺血淋巴中甘油三脂含量呈下降趨勢，但無顯著變化，這與黃曉榮研究鹽度對施氏鱘的影響結(jié)果一致，但甘油三脂隨鹽度的升高變化具有一定差異性，并不是隨著鹽度的升高呈現(xiàn)單一的先上升后下降趨勢，而是呈“波浪式”變化，具體原因還需進(jìn)一步研究。

磷酸酶是生物體內(nèi)的重要代謝調(diào)控酶，也是溶酶體酶的重要組成部分，在貝類非特異性免疫中起到重要作用。王帥等[5]對血蛤的研究表明，鹽度脅迫對磷酸酶活性具有抑制作用，且堿性磷酸酶對鹽度的反應(yīng)比酸性磷酸酶小，且具有滯后性。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，低鹽時(shí)，瘤背石磺血淋巴中堿性磷酸酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性均較高，這可能是因?yàn)榈望}脅迫導(dǎo)致瘤背石磺某些器官，如肝臟，發(fā)生損傷，致使大量酶類釋放至血淋巴中。另外，從上面的白蛋白、球蛋白以及白球比可以看出，低鹽度和高鹽度時(shí)，球蛋白含量顯著提高，白球比顯著降低說明鹽度脅迫已經(jīng)造成瘤背石磺免疫抑制作用。

3.2 鹽度對瘤背石磺免疫應(yīng)激指標(biāo)的影響

鹽度的變化不僅與水生生物的滲透壓調(diào)節(jié) (能量的平衡)、氧吸收和清除率相關(guān)[11-14]，還對其免疫力有顯著影響，如改變鹽度能顯著降低日本囊對蝦、凡納濱對蝦等的血細(xì)胞的數(shù)量和非特異性免疫因子的含量，從而降低其免疫力[15-17]。貝類的體液免疫沒有特異性免疫，只有非特異性免疫，其抗氧化防御系統(tǒng)主要是由一些抗氧化因子構(gòu)成，主要包括SOD、GSH-PX、CAT、GSH 以及 MDA 等，它們聯(lián)合作用保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷。另外，水解酶活性受外源刺激或脅迫的誘導(dǎo)，這也可能是貝類具有可增強(qiáng)的抗性和對脅迫的耐受的原因。在水解酶類中，SOD和CAT是一類清除機(jī)體活性氧自由基的關(guān)鍵酶類，是抵抗超氧陰離子及其活性產(chǎn)物的第一道防線。正常情況下，機(jī)體的自由基含量處于動態(tài)平衡狀態(tài)。然而，環(huán)境脅迫時(shí)機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)的平衡將被打破，造成水解酶活性升高。因此，抗氧化酶活性的變化也用作于指示應(yīng)激的程度。對于CAT，本試驗(yàn)中，鹽度15時(shí)活性最高，高于或低于此鹽度均有所降低，說明長期的鹽度脅迫對CAT有一定的抑制作用。

谷胱甘肽（GSH）在清除體內(nèi)自由基和損傷修復(fù)中起重要的作用，是細(xì)胞合成的重要的抗氧化劑。MDA是機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)氧化的產(chǎn)物，間接反映出細(xì)胞可能被氧化甚至損傷的程度。有研究表明酸性環(huán)境可以促進(jìn)脂質(zhì)的過氧化反應(yīng)[18]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，瘤背石磺血淋巴MDA含量在鹽度25時(shí)最高，說明在此鹽度下，瘤背石磺脂質(zhì)過氧化作用明顯增強(qiáng)，結(jié)合以上抗氧化酶活可以推斷，由于鹽度脅迫應(yīng)激造成的MDA積累可能主要由于活性氧過量產(chǎn)生和積累，同時(shí)活性氧的清除體系——抗氧化酶活性低造成的。

參考文獻(xiàn)：

[1]Huynh M.S.,Ravi F..Growth,survival,haemolymph osmolality and organosomatic indices of the western king prawn(Penaeus latisulcatus Kishinouye)reared at different salinities[J].Aquaculture,2004,234(l-4):601-614.

[2]潘魯青，姜令緒.鹽度、pH突變對2種養(yǎng)殖對蝦免疫力的影響[J].青島海洋大學(xué)學(xué)報(bào),2002,32(6):903-910.

[3]李才文.主要環(huán)境因子對對蝦感染白斑綜合癥的影響研究[D].青島：中國科學(xué)院海洋研究所，2002.

[4]馬洪明.櫛孔扇貝血細(xì)胞形態(tài)研究和抗病功能基因的克隆[D].青島：中國海洋大學(xué)，2004.

[5]王帥，高如承，溫楊敏，等.鹽度突變對中國血蛤非特異性免疫酶活性的影響[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008（5）：213-215.

[6]周玉，郭文場，楊振國，等.魚類血液指標(biāo)研究進(jìn)展[J].上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001,10（2）：163-165.

[7]王愛民，韓光明，封功能，等.飼料脂肪水平對吉富羅非魚生產(chǎn)性能、營養(yǎng)物質(zhì)消化及血液生化指標(biāo)的影響[J].水生生物學(xué)報(bào)，2011，35（1）：80-87.

[8]陳曉鵬.饑餓對黑鯛（Sparus macroephalus）血液指標(biāo)的影響[J].水產(chǎn)科技，2008（4）：19-25.

[9]洪磊.環(huán)境脅迫對魚類生理機(jī)能影響的初步研究[D].青島：中國海洋大學(xué)，2004.

[10]何志謙.人類營養(yǎng)學(xué)（第二版）[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，2000：95-123.

[11]Butt D,Shaddick K,Raftos D.The effect of low salinity on phenoloxidase activity in the Sydney rock oyster,Saccostrea glomerata[J].Aquaculture,2006(251):159-166.

[12]ChengW,Juang F M,Chen J C.The immune response of Taiwan abalone Haliotis diversicolor supertexta and its susceptibility to Vibrio parahaem olyticus at different salinity levels[J].Fish Shellfish Immun,2004(16):295-306.

[13]Malagoli D,Casarini L,Sacchi S,et al.Stress and immune response in the mussel Mytilus galloprovincialis[J].Fish Shellfish Immun,2007(23):171-177.

[14]Bussell J,Gidman E,Causton D,et al.Changes in the immune response and metabolic fingerprint of the mussel Mytilus edulis (Linnaeus)in response to lowered salinity and physical stress[J].J Exp.Mar.Biol.Ecol,2008(358):78-85.

[15]葉建生，王興強(qiáng)，馬甡.鹽度突變對凡納濱對蝦非特異性免疫因子的影響[J].海洋水產(chǎn)研究，2008,29（1）：39-42.

[16]李華，李強(qiáng)，王吉橋.不同鹽度下凡納濱對蝦血淋巴免疫生理指標(biāo)比較[J].中國海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2007,37(6):927-930.[17]馬月釵，楊玉嬌，王國良.鹽度變化對鋸緣青蟹Scylla serrata免疫因子的脅迫[J].中國城建學(xué)會學(xué)術(shù)年會，2010,22（4）：479-484.

[18]蘇詩娟.不同酸堿度和鹽度對對蝦氧自由基的產(chǎn)生和抗氧化系的影響[D].廣州：華南師范大學(xué)，2007.