全巖

（遼寧省蓋州市動物疫病預防控制中心，遼寧蓋州115000）

沙拉沙星是一種動物專用的氟喹諾酮類的藥物。被廣泛應用于防治禽類的大腸桿菌病，同時也被開發(fā)并應用于水產(chǎn)行業(yè)。安普霉素臨床上也主要用治療大腸桿菌等引發(fā)的感染性疾病，為了合理應用抗菌藥，制定合理的給藥方案，本文對沙拉沙星及與安普霉素聯(lián)用的PAE進行了研究。

1 試驗材料

1.1 抗菌藥物

鹽酸沙拉沙星：含量98%，批號98105-99-8，鄭州艾克姆化工有限公司

安普霉素：含量99%，批號37321-09-8，天津康泰生物科技有限公司

1.2 生物/化學試劑

生理鹽水：無菌生理鹽水

牛肉膏：BR，北京弘潤寶順生物科技有限公司，批號68990-09-0

可溶性淀粉：AR，北京康普維科技有限公司，批號9005-8-49

酪蛋白酸性水解物：河南盛之德商貿(mào)有限公司，批號9005-40-3

1.3 試驗菌種

大腸桿菌（吉林農(nóng)業(yè)科技學院實驗室提供）、金黃色葡萄球菌（吉林農(nóng)業(yè)科技學院實驗室提供）

1.4 儀器設備

電子天平∶德國Sartorius，感應量萬分之一。微量加樣器∶100～1000μL，長沙科怡儀器設備有限公司。超凈工作臺，恒溫培養(yǎng)箱，高壓滅菌鍋，電冰箱等。

2 試驗方法

2.1 培養(yǎng)基的制備

MH培養(yǎng)液：稱取牛肉粉5g，酪蛋白酸性水解物17.5g，可溶性淀粉0.15g。加熱溶解后，加蒸餾水至1000mL，調(diào)終pH至7.2～7.4，于121℃下高壓滅菌15min備用。

2.2 抗菌藥物貯存液的制備

精確稱取一定量的沙拉沙星和安普霉素粉劑，分別置于50mL容量瓶中，用超純水充分溶解并定容，使藥液的終濃度為1280μg/mL，此為貯存液。置于冰箱中-20℃低溫保存，使用前需用無菌生理鹽水稀釋成所需濃度，高壓滅菌后置于冰箱在溫度為4℃條件下儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 藥物體外抗菌活性的測定

采用試管液體二倍稀釋法[1]來分別測定兩種藥對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度(MIC)，并將其過程重復3次，取平均值。

2.3.1 實驗前準備工作：實驗中所用到的玻璃儀器均需在高壓滅菌鍋中滅菌。在高壓滅菌鍋中取出15支試管放在試管架上，標號1-15。

2.3.2 實驗過程：用已滅菌的移液管吸取0.9mL的MH培養(yǎng)液于1號試管中，剩余的14支試管中，每支都加入0.5mL培養(yǎng)液。然后再取一支新的移液管吸取抗菌藥物原液0.1mL放于1號試管中，輕輕震蕩搖勻，注意吸取不同的液體需更換移液管，以免引起污染。另取一支移液管從已混勻的1號試管中吸取0.5mL放在2號試管中，混勻后再吸取0.5mL放于3號試管中。如此連續(xù)倍比稀釋至第13管，并從第13管中吸取0.5mL滴到營養(yǎng)瓊脂平板上，進行無菌檢查。這樣，第1～13號試管的藥液濃度分別 為 128μg/mL、 64μg/mL、 32μg/mL、 16μg/mL、 8μg/mL、4μg/mL 、2μg/mL 、1μg/mL 、0.5μg/mL 、0.25μg/mL、 0.125μg/mL、0.06μg/mL、0.03μg/mL。然后，在1號到14號每支試管中均加入已準備好的稀釋菌液0.5mL并蓋上棉塞。另設定最后兩支試管為對照組，14號為只接種菌液的培養(yǎng)物對照，而15號為不加菌液和抗菌藥的培養(yǎng)基對照。最后，將以上所有試管按標號順序排好，與營養(yǎng)瓊脂平板一起放入恒溫培養(yǎng)箱，設置溫度為37℃，培養(yǎng)18～24h，取出觀察試管中的變化。

2.3.3 觀察方法：當對照培養(yǎng)物發(fā)生渾濁時，觀察1-13號試管哪只試管還澄清，則這只試管所對應的藥物濃度就為該藥的最小抑菌濃度（MIC）。

2.4 兩種藥物聯(lián)用體外抗菌活性的測定

聯(lián)合藥敏試驗是以兩種藥物的MIC為基礎，在細胞培養(yǎng)板上以微量棋盤稀釋法進行測定[2]。用MH培養(yǎng)液將安普霉素和沙拉沙星分別稀釋到各藥的 1/4MIC、1/2MIC、1MIC和 2MIC，用微量加樣器吸取稀釋好的安普霉素藥液50μL按濃度由低到高的順序按行加入到細胞培養(yǎng)板上，要注意同行的藥物濃度需一致，每行加5孔；更換槍頭以同樣吸取方法吸取等量稀釋好的沙拉沙星藥液按列加入細胞培養(yǎng)板，同列的藥物濃度也應該一致。另第1行作為不加安普霉素的沙拉沙星對照組而第1列作為不加沙拉沙星的安普霉素對照組；第1列和第1行各孔中分別加入濁度為 2×105CFU·mL-1的菌液 50μL，其余各孔中分別加入濁度為 2×105CFU·mL-1的菌液 100μL，使每孔菌液的終濁度為 1×105CFU·mL-1；將組合好的細胞培養(yǎng)板在37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育18h，采用比濁法進行觀測，記錄兩藥聯(lián)用時的MIC試驗重復3次，結果取平均值。

2.5 體外PAE的測定

2.5.1 對數(shù)期生長菌液的制備

挑取待測菌1～2個單個菌落接種于2mL MH肉湯中，37℃孵育16～18h，以麥氏比濁管校正其濁度為108cfu/mL，用37℃預溫的新鮮MH營養(yǎng)肉湯稀釋100倍，使其濁度為106cfu/mL。

2.5.2 PAE誘導

用已滅菌的移液管分別吸取10MIC、20MIC、40MIC的沙拉沙星各0.2mL與1.8mL濁度為106cfu/mL的對數(shù)生長期菌懸液置于3支15mL試管中，作為實驗管。另取一支試管作為空白對照，只加入1.8mL對數(shù)生長期菌液，以及0.2mL無菌生理鹽水。輕輕振蕩混勻上述四支試管，立即放于37℃恒溫箱中培養(yǎng)1.5h，最終使各管藥物濃度分別為1MIC、2MIC、4MIC、0MIC（空白對照組）。

2.5.3 藥物的去除與重建

采用1000倍稀釋法清除藥物。取上述1MIC、2MIC、4MIC以及空白對照管中的菌液各0.1mL分別加入4支99.9mL在37℃的溫度下預熱的新鮮MH營養(yǎng)肉湯中進行重建，并存放于37℃恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，并將此時記為重建后的零時。

2.5.4 PAE測定

在上述培養(yǎng)條件下于不同時間：0.5、1、2、4、6、8、12、16、24h進行采樣，用MH培養(yǎng)液對樣品進行10倍系列稀釋。在超凈工作臺上用微量加樣器吸取0.1mL菌液放在MH瓊脂平皿上，用接種環(huán)在平皿上輕輕劃線（不要接觸平皿邊緣）于35℃～37℃培養(yǎng)18～20h，選擇生長30～100個菌落的平皿，用菌落計數(shù)器計數(shù)，根據(jù)稀釋度算出每mL菌液的活菌數(shù)。將細菌計數(shù)所得的各時間點的cfu/mL值取常用對數(shù)（lg）為縱坐標，以培養(yǎng)時間(h)為橫坐標作圖，建立實驗菌與對照菌重建后恢復生長的動力學曲線[3]。

2.5.5 PAE計算

依據(jù)細菌重建后恢復生長的動力學曲線，計算出T、C，按照公式PAE=T-C來計算，其中T為實驗組細菌的值高于重建后零時的10倍(1lgcfu/mL)所需要的時間(h)，C為對照組細菌的值高于重建后零時的10倍(1lgcfu/mL)所需要時間(h)[4]。

3 實驗結果

3.1 體外抑菌實驗結果

根據(jù)表3-1可知，沙拉沙星和安普霉素對兩種菌都有較強的抗菌活性，其中沙拉沙星對大腸桿菌單用的MIC值為0.25，小于對金黃色葡萄球菌的MIC，這說明大腸桿菌對沙拉沙星的敏感性要優(yōu)于金黃色葡萄球菌。而單用安普霉素對金黃色葡萄球菌的MIC為0.63，要小于對大腸桿菌的MIC，所以，金黃色葡萄球菌對安普霉素的敏感性優(yōu)于大腸桿菌。根據(jù)表3-1還可以看出安普霉素與沙拉沙星聯(lián)用MIC相對與單用的MIC都有所降低。

表3-1 沙拉沙星和安普霉素聯(lián)用的MIC（μg/mL）（平均值）

3.2 細菌生長的動力學曲線

根據(jù)圖3-1、3-2可以看出同一時間不同濃度的藥物對于細菌的生長繁殖都具有抑制作用，隨著藥物濃度的增大對細菌的生長繁殖的抑制力越強，在前四小時藥物對于細菌的生長抑制較明顯，細菌生長曲線較平緩，而四小時之后細菌的生長緩慢恢復。對比3-1與3-2可以發(fā)現(xiàn)在兩種藥聯(lián)用時，金葡萄球菌的恢復再生長的時間要早于大腸桿菌，這說明，沙拉沙星與安普霉素聯(lián)合應用對大腸桿菌的抑菌效果要強于金葡萄球菌。

圖3-1 金黃色葡萄球菌的生長曲線

圖3-2 大腸桿菌的生長曲線

表3-2 沙拉沙星單用對兩種菌體外PAE結果

表3-3 沙拉沙星與安普霉素聯(lián)合用藥的PAE結果

3.3 PAE測定結果

根據(jù)表3-2可知，沙拉沙星在1MIC～4MIC濃度范圍內(nèi)對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均存在體外PAE且時間有所差異。對比不同濃度藥物對同一種菌的體外PAE可發(fā)現(xiàn)隨著藥物濃度的增加，體外PAE時間均有所延長，呈正相關。由表3-3對比可知，同一濃度沙拉沙星與安普霉素聯(lián)用可有效延長PAE，不同濃度不同種菌類PAE程度有所不同。

4 討論

4.1 在1MIC時，單用沙拉沙星對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的PAE分別為0.92±0.28h、1.15±0.31h，即沙拉沙星對上述細菌都有不同程度的PAE。而沙拉沙星與安普霉素聯(lián)合應用在1MIC對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的PAE分別為1.68±0.26h，1.45±0.25h，相比較而言PAE延長。再者，兩種藥聯(lián)用對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌在藥物濃度為2MIC和4MIC的PAE分別為 2.05±0.35h、2.13±0.27h 和 3.47±0.32h、2.47±0.34h。 從數(shù)據(jù)看出，PAE成明顯的劑量依賴性，且大腸桿菌的PAE值最大。

4.2 本試驗的結果顯示，兩種藥物聯(lián)用對G-（大腸桿菌）的體外PAE的時間比對G+（金黃色葡萄球菌）的體外PAE要長，這可能與沙拉沙星與安普霉素聯(lián)用對G-的殺菌效果更好，給細菌造成了嚴重損傷，所以在清除藥物后，細菌的生長繁殖能力恢復的比較緩慢。

5 結論

以試管二倍稀釋法測MIC操作簡便，準確可靠。本實驗中樣品處理方法采用的是1000倍稀釋法，簡便可靠，藥物去除完全。沙拉沙星對大腸桿菌的MIC為0.25μg/mL，屬于高度敏感；對金黃色葡萄球菌的MIC為1.0μg/mL，屬于中度敏感；而安普霉素對與大腸桿菌的MIC為 2.5μg/mL屬于中度敏感，對金黃色葡萄球菌的MIC為0.63μg/mL，屬于高度敏感，所以這兩種抗生素對這兩種細菌均有較強的抗菌活性。沙拉沙星與安普霉素聯(lián)合用藥的體外PAE較單用沙拉沙星的體外PAE效果較明顯，且PAE大小與藥物濃度呈正相關，并推測其最佳接觸時間為4h左右。

[1]劉明春.司帕沙星體外抗菌活性的試驗[J].中國獸醫(yī)科技,2003(5)：52-54.

[2]黃寶明.安普霉素及其聯(lián)合用藥對三種細菌PAE的研究[D].黑龍江八一農(nóng)墾大學,2010.

[3]黃寶明,王新,崔一喆.安普霉素及其聯(lián)合用藥對大腸桿菌的PAE研究[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學學報.2009(06).

[4]徐叔云,卞如濂,陳修等.藥理實驗方法學（第二版）[M].北京：人民衛(wèi)生出版社.2003,2003,37(10)：30-32.