楊斌 封立平 王簡

摘 要：隨著農(nóng)業(yè)的發(fā)展，對于轉(zhuǎn)基因飼料的應(yīng)用已經(jīng)逐漸普及，但由于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中存在一定的危險性，對其成分的分析和問題的探究要給予重視。因此，本文針對飼料產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分的分析及問題做出了進(jìn)一步探究，對當(dāng)前轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的標(biāo)志管理現(xiàn)狀、飼料中轉(zhuǎn)基因成分的定性檢測方法、飼料中轉(zhuǎn)基因成分的定量檢測方法給出了詳細(xì)的分析。

關(guān)鍵詞：飼料產(chǎn)品；轉(zhuǎn)基因；分析；問題

轉(zhuǎn)基因的發(fā)展非常迅速，大眾對于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性也給予了高度的關(guān)注，很多國家對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品制定了相應(yīng)的管理方案，嚴(yán)格管理轉(zhuǎn)基因植物的加工生產(chǎn)以及貿(mào)易出口等，各個國家對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的管理有著不同的標(biāo)準(zhǔn)和要求，因此比較粗略的轉(zhuǎn)基因技術(shù)并不能滿足復(fù)雜產(chǎn)品的轉(zhuǎn)基因檢測。鑒于此情況，本文針對飼料產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分的分析及問題做出了以下探究。

一、當(dāng)前轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的標(biāo)志管理現(xiàn)狀

每個國家對于飼料轉(zhuǎn)基因成分有著不同的規(guī)定及管理，其中主要包含自愿標(biāo)識以及強(qiáng)制性標(biāo)識兩個種類。在1997年，歐盟首先實(shí)施了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的標(biāo)識制度，之后在50多個國家和地區(qū)中先后頒布了標(biāo)識制度，其中每個國家的制度和閾值如表一所示。除了美國、加拿大以及阿根廷等國家以外，很多國家都應(yīng)用了強(qiáng)制性標(biāo)識的制度，其閾值范圍從歐盟0.9%直到日本的5%。我國于2002年發(fā)表了對于轉(zhuǎn)基因生物進(jìn)行管理的辦法，第一批被列入到標(biāo)志管理的目錄有大豆類產(chǎn)品，如種子、油和豆粉等；玉米類產(chǎn)品如玉米粉和油等；還有油菜籽、棉花類產(chǎn)品等。面對眾多的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，行之有效的檢測方式以及精準(zhǔn)的定量描述是轉(zhuǎn)基因標(biāo)志制度的基礎(chǔ)。因為對其進(jìn)行測定方式的依據(jù)存在不同的基準(zhǔn)物質(zhì)，并且飼料加工會包含很多的轉(zhuǎn)基因作物等，對轉(zhuǎn)基因成分含量進(jìn)行檢測和相應(yīng)的表示方式會存在一定的差異，即使是相同的數(shù)值也很有可能表示不同的含義，因此直接給出相應(yīng)標(biāo)志的工作存在一定的困難。

二、飼料中轉(zhuǎn)基因成分的定性檢測方法

1.生物分析法

生物分析法為利用轉(zhuǎn)入目的基因進(jìn)行表達(dá)的特殊性狀，對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行鑒定的一種方法。例如：含有β-胡蘿卜素的轉(zhuǎn)基因水稻、甜度高但是糖份含量低的玉米。利用這樣的形式，可以有效實(shí)現(xiàn)對原料進(jìn)行第一步篩選，但因為很多轉(zhuǎn)基因當(dāng)中表達(dá)出的特殊性，如抗病蟲害等在作物生長中的體現(xiàn)，不能用在實(shí)驗室的檢測當(dāng)中。

2.DNA檢測法

（1）核酸的提取純化。對核酸進(jìn)行提取的目的是為后續(xù)提供合理的DNA分析。DNA的質(zhì)量涵蓋對DNA分子平均長度、化學(xué)純度以及DNA序列、雙螺旋完全性的提取等。在對DNA進(jìn)行提取的過程中，要對能夠抑制PCR反應(yīng)蛋白質(zhì)、纖維素等進(jìn)行棄除。依照GB/T19495.3-2004可以得出，對不同DNA進(jìn)行提純的方式，可以應(yīng)用在不同的樣品中。當(dāng)前，可以提取在飼料當(dāng)中進(jìn)行應(yīng)用的轉(zhuǎn)基因成分的核算，有很多種方式，其中有三氯甲烷法、聚乙烯吡咯烷酮法、硅土法及胍 - 三氯甲烷法、CTAB法。并且對于這幾種方式的應(yīng)用，已經(jīng)在對飼料樣品的檢驗中取得了成功。在這幾種方法中，對于CTAB的應(yīng)用，更多的應(yīng)用在了對飼料樣品的DNA提取中，并且成功應(yīng)用在了提取玉米、菜籽粕以及大豆蛋白的DNA中。但是，為了能夠更好的保障提取的DNA質(zhì)量，對各個樣品進(jìn)行提取的具體方式，要依照不同作物的成分特征，結(jié)合DNA的具體提取原理和以往的經(jīng)驗對其進(jìn)行合理的改進(jìn)，并將各種方式進(jìn)行比較和對比，挑選出最佳的提取方法。例如：如果提取的樣品含有很高的鹽分，可用清水清洗幾遍；魚骨粉等要先將雜質(zhì)去除，之后在應(yīng)用CTAB法對樣品進(jìn)行制備。

（2）定性PCR法。該項方式的原理為，利用篩選樣品目標(biāo)的核算序列以及定性分析異性檢測，在對照合理以及檢測下限合適的狀況下，實(shí)施定性檢測的結(jié)果要對樣品是否為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行明確的判斷.此種檢測方式包括擴(kuò)增目標(biāo)序列、檢測及擴(kuò)增片段特異性的確證。這種檢測的方式具有極強(qiáng)的靈敏性，并且簡便快速，是對GMF進(jìn)行檢測的最佳方式，但該項方式的應(yīng)用容易產(chǎn)生假陽性的結(jié)果。所以，一般需要通過其它的方式進(jìn)行驗證，如應(yīng)用PCR的產(chǎn)物與PCR凝膠回收的產(chǎn)物，利用凝膠電池實(shí)施檢測。借助對限制性內(nèi)切酶切的具體分析，以及序列和雜交的分析等方式實(shí)施確認(rèn)。在應(yīng)用實(shí)時熒光PCR的方式實(shí)施檢測的過程中，要對擴(kuò)增和檢測一同進(jìn)行。

使用以及存在的問題有：利用PCR法定性來檢測飼料當(dāng)中的轉(zhuǎn)基因成分是當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的鑒定形式，并且該種方式在對轉(zhuǎn)基因大豆、小麥和玉米的檢測研究中獲得了非常大的成功。我國分別制定了 NY/T 675-2003《轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測大豆定性 PCR 方法》標(biāo)準(zhǔn)，可應(yīng)用在轉(zhuǎn)基因抗草甘膦大豆以及相關(guān)的產(chǎn)品中、轉(zhuǎn)基因抗草丁膦大豆和相關(guān)的產(chǎn)品等，涵蓋大豆的種子、豆粕和大豆粉等相關(guān)制品的轉(zhuǎn)基因成分定性PCR的具體檢測；SN/T 1196-2003 《玉米種轉(zhuǎn)基因成分定性PCR 檢測方法》標(biāo)準(zhǔn)，可應(yīng)用在對玉米MON810、Bt11、Event176、T14/T25、CBH351、GA21 品系對其轉(zhuǎn)基因成分的相應(yīng)檢測；SN/T 1943-2007《小麥中轉(zhuǎn)基因成分PCR 和實(shí)時熒光PCR 定性檢測方法》標(biāo)準(zhǔn)，可以應(yīng)用在小麥中轉(zhuǎn)基因成分PCP的定性檢測以及實(shí)時熒光PCR的定性檢測中。對于飼料而言，轉(zhuǎn)基因成分當(dāng)中的外源基因通常包括三個關(guān)鍵的構(gòu)成部分：調(diào)控、目的和標(biāo)記基因。在這三個關(guān)鍵的構(gòu)成部分中，調(diào)控基因包含啟動子以及終止子等。根據(jù)選擇用作模版不同的外源基因，PCR定性檢測實(shí)驗可分為不同的兩類。如果應(yīng)用靶序列擴(kuò)增的基因（包括啟動子和外源基因）該實(shí)驗會具有良好的專一性。如果應(yīng)用的DNA序列在植物當(dāng)中存在較多的序列，如35S 啟動子等，則該實(shí)驗并不具有專一性，該項擴(kuò)增可以檢測不同類的多種轉(zhuǎn)基因飼料，檢測的最終結(jié)果可能會出現(xiàn)假陰性或者假陽性，所以需要應(yīng)用其它的方式驗證。

當(dāng)前，對于該項檢測方式的應(yīng)用雖然比較廣泛，但是還存在一些問題。首先，對于該種方式需要應(yīng)用的試劑和設(shè)備等需要支付高額的費(fèi)用，檢測的方式非常繁雜，會消耗大量的時間和精力，需要很高的操作要求等。其次，該項方式在一定程度上會出現(xiàn)假陽性以及假陰性的結(jié)果。所以，對于多個基因成分進(jìn)行檢測時需要對轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行單獨(dú)鑒定，其工作量會非常大。

三、飼料中轉(zhuǎn)基因成分的定量檢測方法

應(yīng)用熒光定量PCR法。對于該項檢測方式的應(yīng)用，可對PCR的過程進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測，以便得到定量以及定性的結(jié)果，可在閉管的環(huán)境下操作，整個檢測過程只需要很短的時間，操作非常方便，比較容易進(jìn)行推廣。所以，在實(shí)際的檢測中，該項檢測方式成為了重要的檢測技術(shù)。

該項技術(shù)的應(yīng)用原理為：在定量檢測PCR的體系反應(yīng)中，除了對特異的引物進(jìn)行應(yīng)用以外，還提升了與模版DNA匹配、兩端含有熒光基團(tuán)標(biāo)志的探針。PCR酶在經(jīng)歷了一次循環(huán)之后，會構(gòu)成全新的鏈數(shù)，并與釋放出來的熒光基團(tuán)數(shù)呈現(xiàn)出彼此對應(yīng)的關(guān)系。當(dāng)熒光信號的實(shí)際強(qiáng)度大于規(guī)定的閾值時，便會檢測出熒光信號，這時的PCR循環(huán)數(shù)為ct值。

四、結(jié)語

由于轉(zhuǎn)基因技術(shù)的高度發(fā)展，其數(shù)量和種類正在逐步提升。當(dāng)今的飼料產(chǎn)品中包含了大量的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，為了對其危害性進(jìn)行進(jìn)一步控制，要對飼料實(shí)施定性以及定量分析，找出存在的問題，對飼料進(jìn)行嚴(yán)格管理。

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課題來源：山東出入境檢驗檢疫局2016年度科研項目。

課題編號：SK201626。