付立霞, 張 磊, 李欣容, 韓先干, 高 波, 張曉君, 魏文志

(1. 江蘇省人畜共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 揚(yáng)州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 揚(yáng)州 225009； 2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 上海獸醫(yī)研究所， 上海 200241)

菌蛻是近年來(lái)興起的一種新型死菌苗，主要通過(guò)噬菌體PhiX174裂解基因E在革蘭氏陰性菌中的控制表達(dá)進(jìn)行制備。基因E的表達(dá)產(chǎn)物可在細(xì)菌表面形成直徑約40～200 nm的跨膜通道，細(xì)菌胞質(zhì)內(nèi)容物在滲透壓作用下可通過(guò)此通道流出，最終剩下的細(xì)菌空殼即為菌蛻[1]。由于避免了劇烈的化學(xué)或物理滅活過(guò)程，菌蛻可最大限度地保留細(xì)菌表面的原始結(jié)構(gòu)和相關(guān)抗原決定簇，因而具有良好的免疫原性，同時(shí)兼具佐劑的功能，可誘導(dǎo)產(chǎn)生較常規(guī)疫苗更好的免疫保護(hù)效果，其更進(jìn)一步的優(yōu)勢(shì)是可以被開(kāi)發(fā)為抗原、核酸和生物活性物質(zhì)的高級(jí)遞送載體[2-3]。

在菌蛻制備過(guò)程中，裂解基因E的控制表達(dá)可在多種啟動(dòng)子操縱系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄控制下完成，其中又以源自λ噬菌體溫敏突變體的溫控表達(dá)系統(tǒng)λpL/pR-cI857應(yīng)用最為廣泛。在該系統(tǒng)中，受溫敏阻遏蛋白cI857調(diào)控的啟動(dòng)子pR或/和pL可在30℃以下(通常為28℃)時(shí)抑制裂解基因E的表達(dá)，而當(dāng)溫度高于30℃(通常為42℃)時(shí)由于阻遏蛋白被熱激滅活，進(jìn)而啟動(dòng)基因E的表達(dá)。不過(guò)，在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，并非所有細(xì)菌都會(huì)被基因E所介導(dǎo)的裂解作用完全滅活，而且宿主菌基因組和外源質(zhì)粒等遺傳物質(zhì)也不能被完全消除，具有潛在的基因轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)[4-5]。

為了解決上述問(wèn)題，另一種致死基因——金黃色葡萄球菌核酸酶A被引入菌蛻的制備之中[6]。SNA為金黃色葡萄球菌核酸酶的結(jié)構(gòu)基因，其產(chǎn)物具有核酸酶活性，可在鈣、鎂離子存在時(shí)降解單鏈或雙鏈DNA或RNA[7-8]。在實(shí)際應(yīng)用中，出于經(jīng)濟(jì)性和操作便利性考慮，多將裂解基因E和SNA克隆至同一溫控表達(dá)載體，各自置于一個(gè)pR啟動(dòng)子或分別置于pR和pL啟動(dòng)子控制之下，通過(guò)升溫誘導(dǎo)兩者的聯(lián)合表達(dá)[9-11]。兩者的聯(lián)合表達(dá)可使殘存活菌數(shù)在單純基因E介導(dǎo)滅活的基礎(chǔ)上進(jìn)一步下降2個(gè)數(shù)量級(jí)，而值得注意的是，在單表達(dá)溫控系統(tǒng)中單純SNA的誘導(dǎo)表達(dá)卻可使宿主菌活菌數(shù)下降近3個(gè)數(shù)量級(jí)[11-12]，這意味著將SNA從單表達(dá)溫控系統(tǒng)克隆至雙表達(dá)溫控系統(tǒng)中與基因E共表達(dá)時(shí)其作用效率會(huì)下降近一個(gè)數(shù)量級(jí)，這無(wú)疑不利于高效安全菌蛻疫苗的制備。迄今，對(duì)于導(dǎo)致這一差異產(chǎn)生的可能機(jī)制尚缺乏關(guān)注，基于此，本研究通過(guò)將SNA克隆至一雙表達(dá)溫控載體的左向啟動(dòng)子pL之后，通過(guò)升溫誘導(dǎo)SNA表達(dá)，進(jìn)而對(duì)其活性進(jìn)行綜合分析，據(jù)此對(duì)這一問(wèn)題進(jìn)行探討，為進(jìn)一步提高菌蛻制備的效率和安全提供參考。

1　材料與方法

1.1　菌株、質(zhì)粒和試劑

大腸桿菌DH5α，質(zhì)粒pKF396M-5和pFLX107-cSNA由本實(shí)驗(yàn)室保存[11-12]。分子生物學(xué)試劑：PrimeSTAR HS (Premix)，PremixTaq(plus dye)，T4 DNA ligase，Marker DL5000，DL10000以及限制性內(nèi)切酶EcoR I和KpnI等均為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。膠回收試劑盒Gel/PCR DNA，質(zhì)粒和基因組提取試劑盒High-Speed Plasmid Mini Kit，DNA Mini Kit等為Geneaid產(chǎn)品。甲苯胺藍(lán)DNA瓊脂購(gòu)于杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.2　質(zhì)粒pKF396M-5-SNA的構(gòu)建

根據(jù)已發(fā)布SNA基因序列，同時(shí)參照質(zhì)粒pFLX107-cSNA的相應(yīng)結(jié)構(gòu)序列設(shè)計(jì)合成一對(duì)分別含EcoR I和KpnI酶切位點(diǎn)的正反向引物用于含SNA片段的PCR擴(kuò)增。其中正向引物P1：5′-CCGGAATTCATGGAACAACGCATAACCCT-3′；反向引物P2：5′-CGGGGTACCTTATTGACCTGAATCAGCGT-3′(下劃線處序列分別為EcoR I和KpnI酶切位點(diǎn)，斜體序列為保護(hù)堿基)。反應(yīng)體系為50 μL，其中引物P1 (10 μmol/L)，P2 (10 μmol/L)各1 μL ，模板(pFLX107-cSNA)1 μL ，PrimerStar HS (Premix) 25 μL ，滅菌雙蒸水22 μL 。PCR反應(yīng)參數(shù)為：98℃變性10 s，58℃退火20 s，72℃延伸30 s，共25個(gè)循環(huán)，最后再于72℃延伸1 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳后切膠回收，用EcoR I和KpnI對(duì)純化產(chǎn)物進(jìn)行酶切，連入同樣經(jīng)EcoR I/KpnI酶切的pKF396M-5質(zhì)粒中，通過(guò)熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，然后涂布于含氯霉素(35 μg/mL)的LB平板，放入培養(yǎng)箱中于28℃過(guò)夜培養(yǎng)，對(duì)長(zhǎng)出的克隆通過(guò)引物對(duì)P1/M13-47(5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′)進(jìn)行進(jìn)一步PCR鑒定，PCR反應(yīng)條件為：94℃ 預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；最后再于72℃延伸2 min。 PCR鑒定為陽(yáng)性的克隆外送測(cè)序驗(yàn)證，最終構(gòu)建成功的質(zhì)粒命名為pKF396M-5-SNA(圖1)。

圖1 質(zhì)粒pKF396M-5-SNA的物理圖譜

cI857：溫敏阻遏蛋白cI857；pR：lambda噬菌體右向啟動(dòng)子；rrnbT1T2：核糖體RNA操縱子T1T2終止子；pL：lambda噬菌體左向啟動(dòng)子；E：噬菌體phiX174裂解基因E；Ori：復(fù)制起始區(qū)；Cat：氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因

1.3　SNA的誘導(dǎo)表達(dá)

將含有質(zhì)粒pKF396M-5或pKF396M-5-SNA的大腸桿菌DH5α傳代活化后加入100 mL含氯霉素的LB培養(yǎng)基中，于28℃恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)中期后，移入預(yù)熱至42℃的恒溫?fù)u床進(jìn)行誘導(dǎo)，同時(shí)加入MgCl2和CaCl2使終濃度分別為1 mmol/L和10 mmol/L。每隔一定時(shí)間取樣一次，通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)物的OD600監(jiān)測(cè)細(xì)菌的生長(zhǎng)情況，對(duì)升溫誘導(dǎo)0 h和4 h的菌液進(jìn)行平板活菌計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)菌的滅活率。計(jì)算公式為：

滅活率(%)=(1-誘導(dǎo)后CFU/誘導(dǎo)前CFU) ×100%。

1.4　核酸酶活性測(cè)定

核酸酶活性的測(cè)定參照文獻(xiàn)[19]中所述方法進(jìn)行。先制備甲苯胺藍(lán)DNA瓊脂平板，然后用打孔器在平板上均勻打孔(d=3 mm)。待升溫誘導(dǎo)后每隔30 min或1 h取樣離心1次，取10 μL上清加入孔中以測(cè)定培養(yǎng)液上清中的核酸酶活性，同時(shí)對(duì)沉淀菌體以等量LB進(jìn)行重懸煮沸，再次離心后在其他孔中加入10 μL上清以測(cè)定胞內(nèi)核酸酶活性。加樣后的平板均置于28℃過(guò)夜培養(yǎng)。上樣孔周?chē)霈F(xiàn)藍(lán)色消退并呈現(xiàn)出粉紅色圓圈者為陽(yáng)性反應(yīng)，無(wú)變色則為陰性反應(yīng)。

1.5　基因組的提取和檢測(cè)

升溫誘導(dǎo)后每隔1 h取1 mL細(xì)菌培養(yǎng)液，通過(guò)DNA Mini Kit試劑盒進(jìn)行總基因組的提取，相關(guān)操作均按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，通過(guò)0.8%瓊脂糖電泳分析確認(rèn)SNA基因組的降解活性。

2　結(jié)果與分析

2.1　質(zhì)粒pKF396M-5-SNA的構(gòu)建

以質(zhì)粒pFLX107-cSNA為模板，引物對(duì)P1/P2成功擴(kuò)增出預(yù)期大小約為546 bp(含限制性酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，后同)的含SNA目的片段(圖2)；對(duì)構(gòu)建成功的質(zhì)粒通過(guò)引物P1/M13-47進(jìn)行PCR鑒定，可擴(kuò)增出大小約為601 bp的預(yù)期目的片段(圖3)，進(jìn)一步測(cè)序結(jié)果表明，成功構(gòu)建質(zhì)粒pKF396M-5-SNA。

圖2 基因SNA的PCR擴(kuò)增

M：DNA Marker DL5000；1～2：SNA PCR產(chǎn)物；3：空白對(duì)照

圖3構(gòu)建質(zhì)粒的PCR鑒定

Fig 3 PCR identification of the constructed plasmid

M：DNA Marker DL5000；1：鑒定PCR產(chǎn)物；2：空白對(duì)照

2.2　大腸桿菌 DH5α(pKF396M-5-SNA)的生長(zhǎng)曲線

升溫誘導(dǎo)后，轉(zhuǎn)化有質(zhì)粒pKF396M-5-SNA的大腸桿菌DH5αOD600在經(jīng)歷一段時(shí)間快速增長(zhǎng)后趨于平穩(wěn)，最終穩(wěn)定于約1.1左右，而作為對(duì)照的大腸桿菌(pKF396M-5)OD600則在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間一直持續(xù)增長(zhǎng)直至達(dá)到平臺(tái)期OD600=2.0(見(jiàn)圖4)。誘導(dǎo)4 h后，大腸桿菌DH5α (pKF396M-5-SNA)活菌數(shù)從誘導(dǎo)前的9.4×107下降至3.2×105，滅活率為99.7%，而大腸桿菌DH5α(pKF396M-5)活菌數(shù)則從誘導(dǎo)前的1.1×108增加至5.6×108，增加了4.1倍。

2.3　核酸酶活性

大腸桿菌DH5α(pKF396M-5-SNA)升溫誘導(dǎo)后的胞內(nèi)和胞外產(chǎn)物均可使甲苯胺藍(lán)DNA瓊脂呈顯色反應(yīng)，在點(diǎn)樣孔周?chē)纬扇庋劭梢?jiàn)的粉紅色圓圈，不過(guò)被檢出時(shí)間有所不同，而且粉紅圈直徑也存在差異，其中胞內(nèi)核酸酶在升溫誘導(dǎo)30 min后即可被檢出，而胞外核酸酶則在升溫誘導(dǎo)90 min后方被檢出，以最后4組測(cè)量值計(jì)算的平均粉紅圈直徑分別為7.7 mm±0.3 mm和3.9 mm±0.2 mm。對(duì)照組則在歷次核酸酶活性檢測(cè)中均為陰性(圖5)。

圖4 大腸桿菌DH5α的生長(zhǎng)曲線

2.4　宿主菌基因組電泳檢測(cè)

升溫誘導(dǎo)后，在金黃色葡萄球菌核酸酶A的作用下，大腸桿菌DH5α(pKF396M-5-SNA)基因組被成功降解，電泳條帶呈彌散狀(圖6-A)，而作為對(duì)照的大腸桿菌DH5α (pKF396M-5)基因組則未被降解，且在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間濃度不斷增加(圖6-B)

圖5 大腸桿菌DH5α核酸酶活性

3　討論

與常規(guī)疫苗相比，菌蛻完整保留了細(xì)菌原有的表面形態(tài)結(jié)構(gòu)和特性，可刺激機(jī)體產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫反應(yīng)，具有更好的免疫保護(hù)效果[13-14]。借助于基因工程手段還可以構(gòu)建出攜帶外源抗原的重組菌蛻疫苗。此外，菌蛻胞質(zhì)腔還可用于藥物和核酸的遞送，而且菌蛻自身即兼具佐劑的功能，免疫時(shí)無(wú)需再加入佐劑，可避免因使用佐劑所帶來(lái)的副作用[1-3]。正是由于具有以上的諸多優(yōu)點(diǎn)，菌蛻在現(xiàn)代疫苗發(fā)展中日益受到關(guān)注。不過(guò)，單純基因E所介導(dǎo)的裂解作用并不能完全滅活宿主菌，這無(wú)疑會(huì)限制菌蛻的實(shí)際應(yīng)用。

圖6 大腸桿菌DH5α總基因組電泳分析

A：大腸桿菌DH5α(pKF396M-5-SNA)；B：大腸桿菌DH5α(pKF396M-5)。M： DNA Marker DL10000；1～6：誘導(dǎo)后每隔1 h取的樣品

金黃色葡萄球菌核酸酶A是由金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的一種胞外核酸酶。該酶性質(zhì)穩(wěn)定，易于分離和鑒定，相對(duì)分子質(zhì)量小，結(jié)構(gòu)也較簡(jiǎn)單，分子內(nèi)既無(wú)二硫鍵，也不含半胱氨酸，被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的研究[15]。除此之外，在鈣離子存在時(shí)，金黃色葡萄球菌核酸酶可降解單鏈或雙鏈RNA或DNA，鎂離子的存在可以加強(qiáng)這一作用[8]，正是這一特性使其還可作為輔助致死蛋白，用于菌蛻制備過(guò)程中宿主菌的進(jìn)一步滅活及殘存遺傳物質(zhì)的去除，消除潛在的生物安全風(fēng)險(xiǎn)[9-11]，但如前所述SNA在溫控單表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)時(shí)和在雙表達(dá)系統(tǒng)中與基因E共表達(dá)時(shí)對(duì)宿主菌的滅活效率存在近一個(gè)數(shù)量級(jí)的差異。

理論上，兩種可能的因素會(huì)導(dǎo)致上述差異的產(chǎn)生，一是溫控表達(dá)系統(tǒng)本身的結(jié)構(gòu)差異，二是基因E和SNA的表達(dá)會(huì)彼此影響各自的作用效果。本研究中，SNA被置于溫控雙表達(dá)質(zhì)粒pKF396M-5啟動(dòng)子pL之后，同一載體上的pR之后則沒(méi)有外源基因片段插入，且強(qiáng)終止子rrnbT1T2緊鄰其后，這一設(shè)計(jì)可保證SNA最終只受啟動(dòng)子pL控制，便于探究其在溫控雙表達(dá)系統(tǒng)中的單純表達(dá)活性及作用效果。最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在該載體中的SNA經(jīng)升溫誘導(dǎo)后亦可成功降解宿主基因組，對(duì)宿主菌的滅活率也只比前述單表達(dá)載體下的滅活率低0.1%～0.2%，這表明SNA在溫控雙表達(dá)載體中的單表達(dá)仍能如在單表達(dá)載體中一樣有效滅活細(xì)菌，裂解基因E和SNA的共表達(dá)可能才是造成上述差異的主要原因，而這可能又與裂解基因E在宿主菌表面形成的跨膜通道有關(guān)，因跨膜通道的形成會(huì)造成SNA被過(guò)早釋放至胞外，進(jìn)而降低其作用效果。除此之外，在誘導(dǎo)過(guò)程中為了發(fā)揮SNA的最大活性，通常會(huì)向培養(yǎng)液中加入Ca2+和Mg2+溶液，而已有研究結(jié)果顯示Mg2+的存在會(huì)抑制基因E的裂解作用[16]。

鑒于基因E的誘導(dǎo)表達(dá)為菌蛻制備所必須，未來(lái)可通過(guò)提高SNA的作用效率來(lái)進(jìn)一步改進(jìn)菌蛻疫苗的制備，如將SNA錨定于宿主菌內(nèi)膜表面延緩其外釋?zhuān)騼?yōu)化離子配方或誘導(dǎo)程序來(lái)降低對(duì)裂解基因E的抑制效應(yīng)，如是否需要向培養(yǎng)液中加入Mg2+，如果加入又以何時(shí)為宜。這一切，都有待進(jìn)一步研究。

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