江哲珍 祝少博*余黎 汪冰 鄧玲瓏 魏馳

骨肉瘤是青少年和兒童常見的原發(fā)惡性骨腫瘤，其臨床特點是轉移早、預后差、生存率低等[1]。近年來，新輔助化療的開展與應用使患者生存率由之前的15%左右提高到80%左右[2]，但現(xiàn)有化療藥物的毒副作用較大，部分患者因為無法堅持完成化療而導致腫瘤出現(xiàn)轉移或者復發(fā)，治療效果得不到提高[3,4]，這一現(xiàn)象引起了臨床醫(yī)生和腫瘤研究者的極大關注和重視。研究新型、高效低毒的抗腫瘤藥物，對改善骨肉瘤患者的預后具有重要的意義，現(xiàn)已成為骨肉瘤治療研究的重點之一。

左旋含羞草堿（L-Mimosine）是一種從含羞草或銀合歡中提取出來的少見的植物氨基酸，分子量大小為198.2。左旋含羞草堿的化學結構較特殊，與胸腺嘧啶極其相似，但作用不同于目前常用的化學治療藥物[5,6]。研究發(fā)現(xiàn)左旋含羞草堿能夠可逆性抑制哺乳動物的細胞周期，主要在G1/S期起作用，影響細胞DNA復制的啟動及復制鏈的延長[7]。已有研究發(fā)現(xiàn)左旋含羞草堿能夠抑制多種腫瘤細胞的生長增殖，促進腫瘤細胞的凋亡，但左旋含羞草堿作用的確切機制尚不清楚[8-10]。本研究主要探討左旋含羞草堿對骨肉瘤細胞的作用，并初步探討其中的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

骨肉瘤細胞系MG-63和U2-OS購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM-F12培養(yǎng)基、PBS溶液及胰蛋白酶-EDTA（杭州吉諾生物），胎牛血清（Gibco公司），CCK-8試劑盒（日本同仁生物科技有限公司），F(xiàn)ITCAnnexinⅤ-PI凋亡雙染試劑盒（Roche公司），Hoechst33258（Sigma-Aldrich公司），兔抗人p-Histone H2A.x、PI3Kp110 、mTOR、GAPDH一抗（Cell Signaling Technology）。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組

骨肉瘤細胞MG-63及U2-OS用RPMI1640培養(yǎng)基（10%胎牛血清）常規(guī)培養(yǎng)，置入37℃、5%CO2飽和濕度條件下的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；人成骨細胞hFOB1.19在DMEM-F12培養(yǎng)基（10%胎牛血清），置入33.5℃、5%CO2飽和濕度條件下的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。左旋含羞草堿溶于PBS溶液中，實驗時直接加入培養(yǎng)基中達到實驗終濃度，細胞分6組：空白對照組，100 M左旋含羞草堿組，200 M左旋含羞草堿組，400 M 含左旋羞草堿組，100 mg/mL檸檬酸鐵胺組，400 M左旋含羞草堿+100mg/mL檸檬酸鐵胺組。

1.3 CCK-8法檢測細胞增殖

取處于對數(shù)生長期的人骨肉瘤細胞進行培養(yǎng)，待細胞生長至近融合狀態(tài)，用0.25%胰蛋白酶消化細胞,吸管反復將細胞輕輕吹打呈單細胞懸液，用計數(shù)板計數(shù)，將細胞按1500個/孔接種于96孔板，置于37℃、含5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h使細胞完全貼壁生長，按照1.2步驟中的分組加藥處理，每種濃度均設3個復孔。再分別培養(yǎng)24 h、48 h及72 h后取出培養(yǎng)板，每孔加入CCK8試劑10 L孵育1 h，用酶標儀檢測490 nm處培養(yǎng)細胞的OD值，并按以下公式計算細胞生長抑制率：抑制率 (%)=腫瘤細胞抑制率 (IR)=(對照孔OD值-實驗孔OD值)/對照孔OD值×100%。實驗共重復3次，并描繪細胞生長曲線。

1.4 流式細胞術檢測細胞凋亡

取處于對數(shù)生長期的人骨肉瘤細胞或人成骨細胞進行培養(yǎng)，待細胞生長至近融合狀態(tài)，用 0.25%胰蛋白酶消化細胞，將細胞輕輕吹打呈單細胞懸液，用計數(shù)板計數(shù)，將細胞按105個/孔接種于6孔板，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，按照1.2步驟中的分組處理,每種濃度均設3個復孔。培養(yǎng)48 h后，收集細胞，離心，PBS洗滌一次，加入 FITC-Annexin V及PI染料，避光孵育30 min，上機檢測。

1.5 Hochest染色法檢測細胞核固縮

取處于對數(shù)生長期的人骨肉瘤細胞進行培養(yǎng)，待細胞生長至近融合狀態(tài)，用0.25%胰蛋白酶消化細胞，將細胞輕輕吹打呈單細胞懸液，用計數(shù)板計數(shù)，將細胞按104個/孔接種于6孔板，置于37℃、含5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，按照1.2步驟中的分組處理，每種濃度均設3個復孔。培養(yǎng)48 h后，在培養(yǎng)基中加入Hoechst33258至終濃度為10 mg/L，避光孵育30 min，熒光顯微鏡下觀察細胞核固縮比例并拍照。

1.6 蛋白印跡法檢測DNA損傷信號通路關鍵蛋白表達

取對數(shù)生長期的人骨肉瘤細胞進行培養(yǎng)，按3×105個/瓶接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、含5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，按照1.2步驟中的分組處理，每組三瓶，培養(yǎng)48 h后，收集細胞，離心，PBS洗滌一次，加入細胞裂解液提取細胞總蛋白，測定濃度并調整各組一致。聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜及封閉后，分別加入兔抗人p-Histone H2A.x、PI3K p110、mTOR和GAPDH一抗4℃孵育過夜，洗滌后熒光二抗孵育1 h，LI-COR公司odyssey檢測并分析結果。

2 實驗結果

2.1 左旋含羞草堿可以顯著抑制骨肉瘤細胞增殖

CCK-8檢測結果（見圖1-2，彩圖見插頁）顯示，相比于對照組，左旋含羞草堿組的OD值隨著作用時間及濃度的增加而明顯下降，并呈劑量依賴性，且當作用時間為72 h，左旋含羞草堿濃度為400 M時，MG-63及U2-OS細胞的增殖抑制率分別達到81.1%±1.6%和76.7%±2.1%，而在此濃度條件下，加入100mg/mL的FAC后左旋含羞草堿對骨肉瘤細胞的抑制率明顯下降，分別為 13.8%±2.3%和7.5%±1.1%，與400 M左旋含羞草堿組相比，具有明顯的統(tǒng)計學差異（P＜0.001）。

圖1，左旋含羞草堿處理后MG-63細胞增殖曲線。

圖2，左旋含羞草堿處理后U2-OS細胞增殖曲線。

2.2 左旋含羞草堿可以有效誘導骨肉瘤細胞凋亡

流式細胞術檢測結果（見圖3，彩圖見插頁）發(fā)現(xiàn)，各組細胞培養(yǎng)48 h后，相比于對照組，左旋含羞草堿組的細胞凋亡率顯著增高，并隨著左旋含羞草堿濃度的增加而明顯上升，并呈劑量依賴性，且當左旋含羞草堿濃度達到 400 M 時，MG-63及 U2-OS細胞的凋亡率分別為 54.1%±12.6%和46.2%±14.7%，而在此濃度條件下，加入100 mg/mL的 FAC后，MG-63及 U2-OS細胞的凋亡率顯著降低，分別為10.1%±2.4%和7.5%±1.9%，與400 M 左旋含羞草堿組相比，具有明顯的統(tǒng)計學差異（P＜0.001）。不僅如此，在各個濃度條件下的左旋含羞草堿均未對hFOB-1.19造成顯著的細胞凋亡。

圖3，左旋含羞草堿處理后MG-63，U2-OS及hFOB-1.19細胞凋亡率。

2.3 左旋含羞草堿可以顯著誘導骨肉瘤細胞細胞核固縮

Hoechst染色結果（見圖4，彩圖見插頁）顯示，相比于對照組，400 M左旋含羞草堿組細胞核固縮比例顯著增高，MG-63及U2-OS細胞的細胞核固縮比例分別為53.8%±10.6%、49.2%+8.3%，而在此濃度條件下，加入100 mg/mL的 FAC后，MG-63及U2-OS細胞的細胞核固縮比例明顯減少，分別為11.5%±2.0%和13.6%±1.3%，與400 M左旋含羞草堿組相比，均具有明顯的統(tǒng)計學差異（P＜0.001）。

圖4，左旋含羞草堿處理后MG-63及U2-OS細胞Hoechst染色結果。

2.4 左旋含羞草堿調控骨肉瘤細胞DNA損傷修復相關信號通路關鍵蛋白表達

蛋白印跡檢測發(fā)現(xiàn)，各個培養(yǎng)條件下，相比于對照組，左旋含羞草堿組 MG-63細胞的 DNA損傷修復相關蛋白表達水平顯著改變，細胞DNA損傷標記物p-Histone H2A.x表達水平顯著增高，PI3K p110及mTOR蛋白表達水平顯著降低，而加入FAC后，與左旋含羞草堿組相比，p-Histone H2A.x表達水平顯著降低，而PI3K p110及mTOR蛋白表達水平顯著增高。

圖5，左旋含羞草堿處理后MG-63細胞蛋白印跡檢測結果。

3 討論

左旋含羞草堿是從含羞草或銀合歡中提取的生物活性物質，它的生物學活性作用近些年受到較多的研究，具有顯著的抗腫瘤作用，包括前列腺癌、肝癌等[11,12]，其在骨肉瘤中的作用目前尚無研究報道，本研究發(fā)現(xiàn)左旋含羞草堿可以有效抑制骨肉瘤MG-63及U2-OS細胞系的細胞增殖，顯著誘導細胞凋亡及細胞核固縮，并明顯調節(jié)與骨肉瘤MG-63細胞DNA損傷修復相關的蛋白表達。

調節(jié)DNA損傷修復過程是藥物治療腫瘤的分子機制之一，p-Histone H2A.x是細胞出現(xiàn)DNA損傷的標記物之一[13]，本研究發(fā)現(xiàn)左旋含羞草堿處理后，骨肉瘤MG-63細胞中p-Histone H2A.X蛋白表達顯著增高，進而表明左旋含羞草堿可誘導骨肉瘤細胞出現(xiàn)顯著的DNA損傷，達到殺傷腫瘤細胞的作用。PI3K-mTOR信號通路在 DNA損傷及修復過程中發(fā)揮了重要的作用，Davis等的研究表明細胞出現(xiàn) DNA損傷后，PI3K-mTOR信號通路關鍵蛋白會發(fā)生顯著改變，有利于DNA損傷修復[14]，本研究也發(fā)現(xiàn)左旋含羞草堿處理后，骨肉瘤細胞PI3K-mTOR信號通路的關鍵蛋白mTOR及PI3KP110的表達也發(fā)生了顯著下調，但是仍不能代償其對DNA損傷的效應，進而發(fā)生顯著的細胞凋亡。

有研究表明，左旋含羞草堿是一種鐵螯合劑，可以螯合細胞內的二價鐵離子，鐵離子是細胞維持正常生物學功能的重要元素之一[15,16]。左旋含羞草堿誘導腫瘤細胞凋亡的生物學作用是否與這種生物學功能有關需要進一步的研究來證實，本研究的研究結果發(fā)現(xiàn)，在給予左旋含羞草堿處理同時，在細胞培養(yǎng)基中補充富含三價鐵離子的檸檬酸鐵胺，可以顯著減弱左旋含羞草堿抑制骨肉瘤細胞增殖、誘導細胞凋亡的作用，骨肉瘤細胞的DNA損傷標記物p-Histone H2A.X水平顯著降低，PI3K-mTOR信號通路關鍵蛋白表達水平趨于正常，表明左旋含羞草堿誘導骨肉瘤MG-63及U2-OS細胞發(fā)生細胞凋亡與左旋含羞草堿的鐵螯合作用密切相關，這種效應的機制可能是左旋含羞草堿螯合了骨肉瘤細胞內的二價鐵離子，導致骨肉瘤細胞的正常代謝活動受阻，從而引起DNA損傷而誘導骨肉瘤細胞凋亡等下一步的生物學過程。

綜上所述，本研究結果表明，左旋含羞草堿可以有效抑制骨肉瘤細胞增殖并促進骨肉瘤細胞凋亡，其生物機制可能與促進細胞核固縮和調節(jié)細胞內DNA損傷修復相關蛋白的表達有密切關系。因此，對左旋含羞草堿在生物體內的抗腫瘤作用、毒副作用及生物安全性需要做進一步的深入研究，從而為其今后臨床治療骨肉瘤提供更多的實驗依據(jù)，爭取為臨床治療骨肉瘤開辟一條新的道路。

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