張文婷，江 蓮，朱秀麗，劉翠萍，陳 健

強心甾是一類具有強心作用的甾體化合物，臨床上用于治療心力衰竭和心律失常。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，強心甾類藥物可抑制腫瘤細胞的增殖，誘導凋亡，且不影響正常細胞的功能。因此，有學者認為強心甾是一類新型的腫瘤靶向藥物[1]。地高辛是一種臨床上常用的強心甾類藥物，目前少見有關(guān)地高辛對惡性淋巴瘤細胞的作用及其分子機制的研究報道。本研究通過體外培養(yǎng)人B細胞淋巴瘤Raji細胞，觀察強心甾類藥物地高辛對其增殖和凋亡的影響，并檢測Survivin、Caspase-3在細胞中的表達情況，初步探討地高辛對淋巴瘤細胞的作用及其可能的分子機制，為地高辛抗腫瘤的臨床應用提供實驗依據(jù)，并為進一步探討新型抗腫瘤藥物提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人B細胞淋巴瘤Raji細胞株由河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院科研中心提供。

1.1.2 主要試劑 地高辛(純度≥98%)(美國AL公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，RPMI1640培養(yǎng)基、Trizol試劑盒(美國Gibco公司)，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、四甲基偶氮唑藍、100 bp DNA Ladder(北京索來寶生物制品有限公司)，PCR引物(上海捷瑞生物有限公司)，RT-PCR二步法試劑盒、PCR用綠色體系(美國Promega公司)，瓊脂糖、溴化乙錠、乙二胺(美國Sigma公司)。

1.1.3 主要儀器 二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(美國SHELDON公司)，超凈工作臺(美國BIOLOGIC公司)，倒置相差顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，全自動酶標儀(河北省先進醫(yī)療器械有限責任公司)，流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司)，PCR擴增儀(美國ABI公司)，穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京六一儀器廠)，凝膠成像分析系統(tǒng)(美國PE公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及處理 將Raji細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%的滅活胎牛血清、100 U/mL的青霉素、100 μg/mL的鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，2～3 d換液1次，細胞進入對數(shù)生長期用于實驗研究。實驗組細胞培養(yǎng)基中加入DMSO溶解的地高辛，終濃度分別為25 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L和200 nmol/L；對照組細胞培養(yǎng)基中加入與實驗組等體積的DMSO。

1.2.2 四甲基偶氮唑藍實驗 將生長至對數(shù)期的Raji細胞濃度調(diào)節(jié)為1×105/mL，接種于96孔細胞培養(yǎng)板中。實驗組加入終濃度分別為25 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L的地高辛進行培養(yǎng)，對照組加入含終濃度為0.1%DMSO的RPMI-1640培養(yǎng)基，每孔終體積為200 μL。分別培養(yǎng)24、48及72 h后用全自動酶標儀測定吸光度，測定波長為570 nm。細胞抑制率=(1-實驗組吸光度/對照組吸光度)×100%。

1.2.3 檢測細胞凋亡率和周期分布 將生長至對數(shù)期的Raji細胞，細胞濃度調(diào)節(jié)為1×106/mL，實驗組分別加入50 nmol/L，100 nmol/L，200 nmol/L地高辛，對照組加入0.1%DMSO。培養(yǎng)48 h后離心收集細胞，PBS洗滌2次，取1×106/mL樣品0.1 mL，加入碘化丙啶染液1 mL，在4 ℃冰箱避光染色30 min后上機檢測。流式細胞儀測定細胞周期，用流式細胞分析軟件分析凋亡細胞數(shù)及凋亡百分率(apoptotic percentage,AP)，并用Muticycle AV分析軟件對DNA細胞周期進行擬合分析。

1.2.4 檢測Raji細胞中Survivin、Caspase-3 mRNA表達水平 實驗分組同上，不同濃度地高辛與Raji細胞作用48 h，細胞總RNA提取及RT-PCR步驟按試劑盒說明書進行，將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以其為模板進行PCR擴增。Survivin引物：上游5′-GCATGGGTGCCCCGACGTTG-3′，下游5′-GCTCCGGCCAGAGGCCTCAA-3′，擴增產(chǎn)物為447 bp；Cas-pase-3引物：上游5′-GGTGTTGATGATGACATGGCG-3′；下游5′-GTACCCTCTGCAGCATGAGAGTAG-3，擴增產(chǎn)物為417 bp；β-actin引物：上游5′-TGAGACCTTCAACACCCCAG-3′，下游：5′-GCCATCTCTTGCTCGAAGTC-3′，擴增產(chǎn)物為312 bp。

配置含0.5 μg/mL溴化乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠，取PCR產(chǎn)物點樣電泳，在凝膠圖像分析儀分析。測定各電泳條帶的灰度值(A)，用β-actin的A值作為內(nèi)參，表達強度以Survivin A值/β-actin A值、Caspase-3 A值/β-actin A值的比值作為目的基因的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 地高辛對Raji細胞增殖的影響 25 nmol/L,50 nmol/L,100 nmol/L,200 nmol/L地高辛作用于Raji細胞24 h、48 h和72 h后，與對照組相比，增殖活性均有不同程度的下降。除25 nmol/L地高辛作用Raji細胞24 h后與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義外(P>0.05)，其余各實驗組與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。隨著時間的增加，增殖抑制率呈遞增趨勢。表明地高辛在一定濃度范圍內(nèi)，對Raji細胞有不同程度的增殖抑制作用，此作用呈劑量-效應和時間-效應依賴關(guān)系(表1，圖1)。

表1 不同濃度地高辛作用于Raji細胞 24、48、72 h后吸光度值變化

注：與對照組比較，*P<0.05；與25 nmol/L比較，△P<0.05；與50 nmol/L比較，◆P<0.05；與100 nmol/L比較，☆P<0.05

圖1 不同濃度地高辛作用于Raji細胞 24 h、48 h、72 h后增殖抑制率變化

2.2 地高辛對Raji細胞周期的影響 50 nmol/L、100 nmol/L和200 nmol/L地高辛作用于Raji細胞48 h后，細胞周期分布均發(fā)生變化，G0/G1期和S期細胞數(shù)減少，G2/M期細胞數(shù)增加。實驗組Raji細胞G2/M期細胞數(shù)與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(F=122.030，P<0.05)。由此說明地高辛可阻滯Raji細胞于G2/M期，隨著地高辛濃度的增加，阻滯作用增強，呈一定劑量-效應依賴關(guān)系(表2)。

表2 不同濃度地高辛作用于Raji細胞48 h后 細胞周期的變化

注：與對照組比較，*P<0.05；與50 nmol/L比較，△P<0.05；與100 nmol/L比較，◆P<0.05

2.3 地高辛對Raji細胞凋亡的影響 50 nmol/L、100 nmol/L和200 nmol/L地高辛作用于Raji細胞48 h后，出現(xiàn)明顯的凋亡峰，而對照組未見凋亡峰或僅有低平的凋亡峰。經(jīng)單因素方差分析，各實驗組地高辛作用Raji細胞48 h后的細胞凋亡率與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(F=36.409，P<0.05)，說明隨著地高辛濃度增加，引起Raji細胞凋亡率逐漸增大，即凋亡細胞數(shù)與地高辛濃度呈劑量-效應依賴關(guān)系(表3)。

表3 不同濃度地高辛作用于Raji細胞48 h后 細胞凋亡率的變化

2.4 地高辛對Raji細胞Survivin、Caspase-3 mRNA表達水平的影響 RT-PCR檢測結(jié)果顯示，50 nmol/L、100 nmol/L和200 nmol/L濃度地高辛作用于Raji細胞48 h后，Survivin mRNA的相對表達量低于對照組(F=504.383,P<0.05)，并隨作用濃度增加相對表達量降低，同時Caspase-3 mRNA的相對表達量高于對照組(F=391.506,P<0.05)，并隨作用濃度增加相對表達量增高(表4，圖2，圖3)。

表4 不同濃度地高辛作用于Raji細胞48 h后 Survivin、Caspase-3 mRNA表達的比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與50 nmol/L比較，△P<0.05；與100 nmol/L比較，◆P<0.05

圖2 不同濃度地高辛作用于Raji細胞48 h后 Survivin mRNA和β-actin mRNA的表達

圖3 不同濃度地高辛作用于Raji細胞48 h后 Caspase-3 mRNA和β-actin mRNA的表達

3 討論

淋巴瘤為兒童常見惡性腫瘤之一，據(jù)流行病學資料顯示，我國每年新發(fā)的兒童淋巴瘤病例為6 000～8 000例，其中80%左右為非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma,NHL)[2]。雖然隨著化療方案的調(diào)整和改進，NHL的緩解率有了較高提升，但原發(fā)耐藥和反復復發(fā)仍是影響治療效果的因素之一。傳統(tǒng)化療藥物造價昂貴，兒童對化療耐受性較成年患者差，常易出現(xiàn)嚴重骨髓抑制、合并重癥感染等，限制了用藥強度。因此探索高效低毒的治療藥物，已成為當前研究的熱點。近年研究發(fā)現(xiàn)強心甾類藥物除了強心等作用外，還可以有效地殺傷人胰腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、白血病等多種腫瘤細胞[3-7]，能選擇性地抑制相應腫瘤細胞的增殖或誘導其凋亡。研究者們推測強心甾類物質(zhì)極有希望成為新的抗腫瘤藥物，提出其可以單藥治療、聯(lián)合化療藥物輔助并可增強放療敏感性，用于腫瘤的治療[8-9]，因此越來越受到人們的關(guān)注。

地高辛是一種臨床上常用的口服劑型的強心甾類藥物，來源于玄參科植物洋地黃，服用方便，起效速度快，作用時間較短，濃度易于測定，應用最為廣泛。早期地高辛被認為具有抗腫瘤作用是因為Stenkvist等[10]發(fā)現(xiàn)，服用地高辛的乳腺癌患者復發(fā)率及死亡率均較未口服者低。近年來，有研究對47 884例患者20年(1986～2006年)的追訪重新評估了地高辛與前列腺癌的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)定期服用地高辛的患者，特別是服用時間超過10年以上的患者，患前列腺癌的風險較低。地高辛在體外可有效抑制前列腺癌細胞的生長，它的使用使患前列腺癌的風險降低25%[11]。Pereira等[12]發(fā)現(xiàn)地高辛與順鉑聯(lián)合應用，能起到協(xié)同作用，增強對宮頸癌Hela細胞增殖抑制，減少順鉑化療的毒性反應。地高辛抗腫瘤作用機制復雜，已發(fā)現(xiàn)其可能通過抑制Na+/K+-ATPase活性、激活Ras和MAPK途徑引起線粒體損傷，或通過抑制HIF-1α轉(zhuǎn)錄而減少蛋白質(zhì)合成等多種途徑抑制腫瘤細胞增殖，誘導凋亡[6，13]。

腫瘤是一類細胞周期調(diào)控機制遭到破壞的疾病，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細胞周期的分布密切相關(guān)。G2/M期是細胞周期的一個重要的調(diào)節(jié)點，是細胞增殖的關(guān)鍵[14]。本研究結(jié)果顯示，地高辛能夠明顯減少G0/G1和S期的Raji細胞，增加G2/M期細胞數(shù)。推測地高辛的作用機制可能是將細胞抑制在G2/M期的限制點內(nèi)從而使細胞的增殖受到抑制。同時，地高辛對Raji細胞具有明顯的誘導凋亡作用。地高辛作用于Raji細胞48 h后出現(xiàn)凋亡峰，且呈濃度依賴關(guān)系。

Survivin是迄今為止凋亡抑制蛋白家族中所發(fā)現(xiàn)的分子量最小、作用最強的凋亡抑制因子。它在多種腫瘤組織中高表達，而在正常組織及癌旁組織中無表達或低表達[15]，與腫瘤細胞的增殖、分化及浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Ambrosini等[16]首次報道了Survivin與NHL之間的關(guān)系，提示Survivin在NHL中高表達。有研究表明Survivin的表達與NHL的惡性程度呈正相關(guān)，常預示著較差的預后[17]。Adida等[18]用免疫組織化學方法檢測了222例彌漫大B細胞淋巴瘤組織中Survivin的表達，其陽性率為60%，且Survivin表達陽性者，5年生存率明顯低于Survivin陰性者。鑒于Survivin具有獨特的組織分布特點，使其在腫瘤治療時可發(fā)揮不傷及正常組織的特性，所以Survivin有可能會成為較理想的抗腫瘤潛在靶點[19]。Survivin可通過調(diào)節(jié)Caspase級聯(lián)反應中Caspase-9、Caspase-3、Caspase-7，抑制各種刺激誘導的細胞凋亡[20-21]。Survivin最終通過抑制終末效應蛋白Caspase-3來抑制細胞的凋亡。Caspase-3是Caspase家族中重要的凋亡執(zhí)行者，活化的Caspase-3通過特異性地裂解一系列底物而直接導致細胞死亡。本研究實驗組與對照組相比，Survivin mRNA含量明顯降低，Caspase-3 mRNA表達明顯升高，表明地高辛可以通過下調(diào)Survivin，激活Caspase-3的表達來促進淋巴瘤細胞的凋亡。

綜上所述，強心甾類藥物地高辛對Raji細胞生長具有明顯的抑制作用，其可能涉及的機制包括使Raji細胞阻滯于G2/M期，抑制細胞增殖；通過下調(diào)Survivin的表達、活化Caspase-3來誘導細胞凋亡。本研究對強心甾類藥物抗淋巴瘤機制進行了初步探討，為強心甾類藥物應用于淋巴瘤治療提供了新的思路。但其在體內(nèi)的作用有待于進一步研究，且地高辛過量會引起心臟毒性。目前，研究人員已在探索合適的地高辛抗腫瘤治療劑量，希望其既能發(fā)揮抗腫瘤作用，又不增加毒性反應[22]。將地高辛與其他化療藥物聯(lián)合應用有可能成為今后淋巴瘤治療中的一種更好選擇。

【參考文獻】

[1]Newman RA,Yang P,Pawlus AD,et al.Cardiac glycosides as novel cancer therapeutic agents[J].Mol Interv,2008,8(1):36-49.

[2]桂林，石遠凱，何小慧，等. 妊娠期淋巴瘤21例臨床病理特征分析[J].中華醫(yī)學雜志,2015,95(6):425-429.

[3]Liu X,Xiao XY,Shou QY,et al.Bufalin inhibits pancreatic cancer by inducing cell cycle arrest via the c-Myc/NF-κB pathway[J].J Ethnopharmacol,2016,193:538-545.

[4]Anderson SE,Barton CE.The cardiac glycoside convallatoxin inhibits the growth of colorectal cancer cells in a p53-independent manner[J].Mol Genet Metab Rep,2017,13:42-45.

[5]Kaushik V,Yakisich JS,Azad N,et al.Anti-tumor effects of cardiac glycosides on human lung cancer cells and lung tumorspheres[J].J Cell Physiol,2017,232(9):2497-2507.

[6]Zeino M,Brenk R,Gruber L,et al.Cytotoxicity of cardiotonic steroids in sensitive and multidrug-resistant leukemia cells and the link with Na(+)/K(+)-ATPase[J].J Steroid Biochem Mol Biol,2015,150:97-111.

[7]Diederich M,Muller F,Cerella C.Cardiac glycosides:from molecular targets to immunogenic cell death[J].Biochem Pharmacol,2017,125:1-11.

[8]Kapoor S.Digoxin and its antineoplastic properties:an evolving role in oncology[J].J Pediatr Hematol Oncol,2014,36(8):666-667.

[9]Slingerland M,Cerella C,Guchelaar HJ,et al.Cardiac glycosides in cancer therapy:from preclinical investigations towards clinical trials[J].Invest New Drugs,2013,31(4):1087-1094.

[10]Stenkvist B,Bengtsson E,Eriksson O,et al.Cardiac glycosides and breast cancer[J].Lancet,1979,1(8115):563.

[11]Varbanov HP,Kuttler F,Banfi D,et al.Repositioning approved drugs for the treatment of problematic cancersusing a screening approach[J].PLoS One,2017,12(2):e0171052.[12]Pereira DG,Salgado MAR,Rocha SC,et al.Involvement of Src signaling in the synergistic effect between cisplatin and digoxin on cancercell viability[J].J Cell Biochem,2018,119(4):3352-3362.

[13]Zhang H,Qian DZ,Tan YS,et al.Digoxin and other cardiac glycosides inhibit HIF-1alpha synthesis and block tumor growth[J].Proc Natl Acad Sci USA,2008,105(50):19579-19586.

[14]Le AP,Zhang LL,Liu W,et al.Cantharidin inhibits cell proliferation and induces apoptosis through G2/M phase cell cycle arrest in hepatocellular carcinoma stem cells[J].Oncol Rep,2016,35(5):2970-2976.

[15]Altieri DC.Survivin-the inconvenient IAP[J].Semin Cell Dev Biol,2015,39:91-96.

[16]Ambrosini G,Adida C,Altieri DC.A novel anti-apoptosis gene,survivin,expressed in cancer and lymphoma[J].Nature Med,1997,3(8):917-921.

[17]Kaneko N,Mitsuoka K,Amino N,et al.Combination of YM155, a survivin suppressant, with bendamustine and rituximab:a new combination therapy to treat relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma[J].Clin Cancer Res,2014,20(7):1814-1822.

[18]Adida C，Haioun C，Gaulard P，et al.Prognostic significance of surviving expression in diffuse large B-cell lymphomas[J].Blood,2000,96(5):1921-1925.

[19]Garg H,Suri P,Gupta JC,et al.Survivin:a unique target for tumor therapy[J].Cancer Cell Int,2016,16:49.

[20]Wang J,Jin Y,Xu Z,et al.Involvement of caspase-3 activity and survivin downregulation in cinobufocini-inducedapoptosis in A 549 cells[J].Exp Biol Med (Maywood),2009,234(5):566-572.

[21]Rubio N,Garcia-Segura LM,Arevalo MA.Survivin prevents apoptosis by binding to caspase-3 in astrocytes infected with the BeAn strain of Theiler’s murine encephalomyelitis virus[J].J Neurovirol,2012,18(5):354-63.

[22]Zhang XH,Wang XY,Zhou ZW,et al.The combination of digoxin and GSK2606414 exerts synergistic anticancer activity against leukemia in vitro and in vivo[J].Biofactors，2017,43(6):812-820.