李赫，胡宗云，張健，宋文華，富麗靜

（遼寧省淡水水產(chǎn)科學研究院，遼寧省水生動物病害防治重點實驗室，遼寧 遼陽 111000）

草魚肉質(zhì)細嫩、營養(yǎng)價值高，倍受人們的青睞，已成為池塘高密度集約化養(yǎng)殖的主要種類之一。但是，由于養(yǎng)殖密度過高、水體環(huán)境惡化，病害越來越嚴重，給草魚養(yǎng)殖業(yè)帶來了十分巨大的損失。而長期大量使用抗生素會出現(xiàn)耐藥菌株和變異株，有效防治更加困難。中草藥是天然藥物，資源豐富，安全性高、毒副作用少，殘留低、不易引起藥源性疾病和產(chǎn)生耐藥性，對環(huán)境污染少[1,2]；中草藥還有促進生長、調(diào)節(jié)免疫力和提高機體抗病力等作用[3,4]。金珊等[5]研究了中草藥對海水養(yǎng)殖鱸病原菌的抑菌效果；李茜等[6]試驗了23種中草藥及復方對鯽腸道3種細菌的體外抑菌效果；陶健等[7]研究了21種、陳霞等[8]研究了47種中草藥及復方制劑對嗜水氣單胞菌的體外抑菌效果，都證明中草藥具有良好的抗菌抑菌作用。本試驗研究了16種中草藥對2株草魚致病性細菌的體外抑菌效果，從中篩選出對兩種致病菌有較好抑菌作用的藥物，為防治該致病菌引起的疾病提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

實驗用菌株由本實驗室從遼寧地區(qū)池塘患病草魚內(nèi)臟中分離、保存，分別編號為H4和H35。回歸感染實驗證實該菌株為致病菌，致病性較強。生理生化試驗和16S rDNA序列分析證明，H4為嗜水氣單胞菌Aeromonas hydrophila，H35為類志賀鄰單胞菌Plesiomonas Shigelloides。

1.1.2 培養(yǎng)基

液體培養(yǎng)基配方為：蛋白胨10g、牛肉膏3g、鹽5g、蒸餾水 1 000mL，pH 調(diào)至 7.0～7.2。固體培養(yǎng)基為每1 000mL液體培養(yǎng)基加入18 g瓊脂。

1.1.3 中草藥

實驗所用的16種中草藥為地膚子、小茴香、茯苓、蛇床子、牡丹皮、黃芪、陳皮、藿香、豬苓、高良姜、黃柏、苦參、昆布、肉桂、姜黃和丁香，購自遼陽市博大藥房。

1.2 方法

1.2.1 藥液的制備

將16種中草藥分別放于60℃恒溫干燥箱中烘至恒重后粉碎，80目篩過濾備用。稱取50g中草藥，加500mL蒸餾水，室溫浸泡24h后，文火煎煮30 min，濾出煎液，重復三次，合并濾液，濃縮至生藥含量1g/mL，121℃滅菌20min，置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 抑菌效果的測定

采用瓊脂擴散法測定抑菌效果：用打孔機將1#定性濾紙打成直徑為6mm的圓形紙片，經(jīng)121℃滅菌20min后，分別浸入各中藥水提液中，待其干燥后，在無菌條件下平鋪在涂有菌液的固體培養(yǎng)基平板上；對照組用無菌蒸餾水浸泡紙片。28℃下培養(yǎng)24h后，測定抑菌圈直徑。

結(jié)果判定：抑菌圈直徑≥20mm為極敏，用“+++”表示；15～19mm 為高敏，用“++”表示；10～14mm為中敏，用“+”表示；＜10mm以下為低敏，用“-”表示[9]。

1.2.3 菌懸液的制備

挑取適量凍干菌種，接種于液體培養(yǎng)基中，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h，以接種環(huán)蘸取菌液在瓊脂平板上劃線，培養(yǎng)24h，挑取單個菌落接種于固體培養(yǎng)基上，28℃下培養(yǎng)18h后，用無菌生理鹽水將菌體沖洗下來。使用麥氏比濁法，將菌液濃度稀釋至1×107CFU/mL，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 最小抑菌質(zhì)量濃度（MIC）測定

采用二倍稀釋法[10]測定16種中草藥藥液對兩株細菌的最小抑菌質(zhì)量濃度（MIC）。每種中草藥取滅菌試管7支，分別編號；第1號試管內(nèi)加入2.5mL藥物原液，2～7號試管每支加2.5mL液體培養(yǎng)基，2號管加2.5mL藥液，充分混勻后吸取2.5mL至3號試管中，依次倍比稀釋至7號試管，棄去2.5mL。1～7號試管均加入100μL菌液，搖勻，每種中草藥重復3次；另準備3支試管作為對照管，在其中加入2.5mL液體培養(yǎng)基和100μL菌液。將所有試管放置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，觀肉眼察結(jié)果。藥物最低濃度管中無細菌生長者即為最小抑菌質(zhì)量濃度（Minimal InhibitoryConcentration，MIC）。

1.2.5 最小殺菌質(zhì)量濃度（MBC）測定

在最小抑菌質(zhì)量濃度試驗基礎上，從無明顯細菌生長的試管中用涂布棒蘸取營養(yǎng)液，涂布于瓊脂平板培養(yǎng)基，放于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。以平板培養(yǎng)基上無菌落生長的最低藥物濃度作為最小殺菌質(zhì)量濃度（Minimal Bactericidal Concentration，MBC）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同中草藥的抑菌效果比較

16種中草藥對兩株細菌的抑菌活性各不相同（表1）。其中，茯苓、昆布和姜黃對H4的抑菌圈明顯，直徑分別為（23.86±0.22）mm、（21.73±0.71）mm、（20.73±0.33）mm，抑菌作用強（＋＋＋）；小茴香、肉桂對H4抑菌作用中等（＋＋）；蛇床子、丁香對H4抑菌作用低（＋）；地膚子等9種中草藥對H4無抑菌作用（-）。黃芪、丁香對H35抑菌圈明顯，直徑分別為（17.66±0.35）mm、（18.93±0.37）mm，抑菌作用中等（＋＋）；牡丹皮、肉桂對H35抑菌作用低（＋）；地膚子等10種中草藥對H35無抑菌作用（-）。

表1 16種中草藥對H4和H35的抑菌效果Tab.1 Antibacterial effect of 16 kinds of Chinese herbal medicine on H4 and H35

2.2 不同中草藥對2株細菌的最小抑菌質(zhì)量濃度和最小殺菌質(zhì)量濃度

16種中草藥有效成分對2株細菌的MIC和MBC的測定結(jié)果見表2。茯苓對H4的MIC和MBC最小，MIC 為 15.63mg/mL，MBC 為 31.25mg/mL；小茴香、昆布、姜黃次之，其MIC均為31.25mg/mL，其MBC分別為125mg/mL、125mg/mL和62.5mg/mL；蛇床子、肉桂、丁香、豬苓、黃柏對H4也有一定的抑菌作用，其MIC分別為125mg/mL、62.5mg/mL、125mg/mL、250mg/mL和250mg/mL，其MBC分別為250mg/mL、62.5mg/mL、125mg/mL、500mg/mL 和 500mg/mL；地膚子、牡丹皮、黃芪、陳皮、藿香、高良姜、苦參對H4的MIC和MBC最大，其MIC和MBC均大于1 000 mg/mL。

丁香對H35的MIC和MBC最小，MIC和MBC均為31.25mg/mL；黃芪、牡丹皮、陳皮、肉桂、高良姜次之，MIC 分別為 62.5mg/mL、125mg/mL、125mg/mL、250mg/mL 和 125mg/mL，MBC 分別為 125mg/mL、125mg/mL、250mg/mL、500mg/mL和 125mg/mL；地膚子、小茴香、茯苓、蛇床子、藿香、豬苓、黃柏、苦參、昆布、姜黃對H35的MIC和MBC最大，其MIC和MBC均大于1 000mg/mL。

表2 16種中草藥對H4和H35的MIC和MBCTab.2 MIC and MBC of 16 kinds of Chinese herbal medicine on H4 and H35

3 討論

類志賀鄰單胞菌是一種人畜共患菌，不僅能引起人類菌血癥、腸胃炎、腦膜炎等[11,12]，也是魚類的一種潛在致病菌，對羅氏沼蝦、斑點叉尾等[13,14]多種水生動物均有致病性。類志賀鄰單胞菌對草魚的感染死亡報道較少。胡錢東[15]等首次報道了志賀鄰單胞菌是草魚肌肉糜爛病的致病菌，對草魚有致病性。張新艷等[16]報道了志賀鄰單胞菌引起草魚的發(fā)病率可達50%以上，死亡率為10%～15%。

嗜水氣單胞菌是我國流行比較廣泛的一種人畜共患的條件致病菌，是淡水魚類爆發(fā)性傳染病的主要病原菌之一，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[17]。嗜水氣單胞菌對草魚具有很強的致病性，主要引起細菌性敗血癥，以全身出血為主要癥狀，同時感染或混合感染嗜水氣單胞菌也可引起腸炎和爛鰓癥狀[18]。草魚細菌性敗血癥是引起經(jīng)濟損失最為嚴重的病害之一。

目前，在漁業(yè)生產(chǎn)中，主要使用抗生素防治細菌性疾病，但濫用、錯用和不規(guī)范使用抗生素，不僅導致嚴重的藥物殘留，威脅人類健康，還會增加耐藥菌株，增強耐藥性[19]，因而中草藥的應用日益受到關注。中草藥在水產(chǎn)動物疾病防治中的應用已有報道。汪黎虹等[20]測定了10種中藥對18株鰻鱺（Anguilla japonica Temminck et Schlegel）常見致病菌的抑制效果，發(fā)現(xiàn)10種中藥對除B12以外的17株養(yǎng)殖鰻鱺主要致病菌均有一定的抑制作用。張海賓等[21]選取12種中草藥對嗜水氣單胞菌的敏感性試驗表明，五倍子、大黃、烏梅、黃芩、黃連的抑菌圈直徑大，抑菌濃度低，藥效持久。

本試驗測定了16種中草藥對2株草魚致病菌的抑殺菌效果。結(jié)果表明，對嗜水氣單胞菌（H4）的抑菌效果由高到低依次為：茯苓＞小茴香、昆布、姜黃＞肉桂＞蛇床子、丁香＞豬苓、黃柏；對類志賀鄰單胞菌（H35）的抑菌效果由高到低依次為：丁香＞黃芪＞牡丹皮、陳皮、肉桂、高良姜。本實驗結(jié)果顯示，姜黃對嗜水氣單胞菌的抑菌圈直徑為（20.73±0.33）mm，這與喻鵬飛等[22]報道的結(jié)果相一致，說明姜黃對嗜水氣單胞菌有較好的抑菌效果；丁香和黃柏對嗜水氣單胞菌的MIC分別為125mg/mL和250mg/mL，這與張文青等[23]（50mg/mL和100mg/mL）的報道不同。賴曉健等[24]研究發(fā)現(xiàn)，丁香對太平洋雙色鰻鱺Anguilla bicolor pacifica致病性類志賀鄰單胞菌的抑菌效果最好，其MIC為4mg/mL，而本試驗中丁香對類志賀鄰單胞菌的MIC為31.25mg/mL，出現(xiàn)上述差異可能有兩個原因，一是中草藥產(chǎn)地不同，二是細菌來源不同。本試驗結(jié)果表明，可以用中草藥防治由該2株細菌引起的水產(chǎn)動物疾病，但中草藥在體內(nèi)的抗菌效果與體外并不一致，其有效成分在體內(nèi)和體外發(fā)揮作用的環(huán)境相差較大，體內(nèi)的各種消化液、酶、激素等化學成分影響很大，所以本試驗結(jié)果僅供參考。同種中草藥對不同菌株的抑制作用也不同，實際應用時應先確定致病菌的種類，再區(qū)別用藥。

綜上所述，茯苓和丁香可以分別作為嗜水氣單胞菌和類志賀鄰單胞菌引起的水產(chǎn)動物疾病的有效防治藥物，其次是小茴香、昆布、姜黃、肉桂、蛇床子、丁香、豬苓、黃柏（H4）及黃芪、牡丹皮、陳皮、肉桂、高良姜（H35）。用中草藥防治魚病時，可根據(jù)藥物的性質(zhì)，適當配伍，發(fā)揮藥物的協(xié)同作用，提高療效。

［1］張傳亮,李槿年,李小飛.擬態(tài)弧菌的致病性、耐藥性及中草藥防治弧菌病應用［J］.水利漁業(yè),2007,27（1）:96-98.

［2］王玉娥,邢晨光,王國良.5種海洋致病弧菌對34種中草藥敏感性的測定［J］.水產(chǎn)科學,2008,27（5）:221-225.

［3］王斌,趙文,范薇,等.復方中藥制劑對草魚免疫細胞功能及抗病力影響的初步研究［J］.大連水產(chǎn)學院學報,2007,22（3）:203-206.

［4］溫周瑞,劉慧集,駱敏,等.中草藥對水產(chǎn)動物免疫作用研究進展［J］.水利漁業(yè),2004,24（2）:1-3.

［5］金珊,王國良,趙青松,等.中草藥對海水養(yǎng)殖鱸魚病原菌的抑菌效果研究［J］.海洋科學,1999（5）:8-10.

［6］李茜,張懿瑾,華汝泉,等.23種中草藥及復方對鯽腸道3種細菌的體外抑菌試驗［J］.淡水漁業(yè),2007,37（4）:7-11.

［7］陶健,李紹戊,劉紅柏.21種中草藥及復方制劑對嗜水氣單胞菌的體外抑菌作用［J］.水生態(tài)學雜志,2013,34（3）:90-93.

［8］陳霞,張其中,李春濤.47種中草藥體外抑殺嗜水氣單胞菌的藥效研究［J］.水產(chǎn)科學,2012,31（7）:387-391.

［9］李義奎,王欽茂.中藥藥理實驗方法學［M］.上海:上?？茖W技術出版社,1991:286-292.

［10］戴自英.臨床抗菌藥物學［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社,1985:20-22.

［11］ Khan A M,Faruque A S G,Hossain M S,et al.Plesiomonasshigelloides-associateddiarrhoeainBangladeshi children:a hospital-based surveillance study［J］.Journal ofTropical Pediatrics,2004,50（6）:354-356.

［12］Ozdemir O,Sari S,Terzioglu S,et al.Plesiomonas shigelloides sepsis and meningoencephalitis in a surviving neonate［J］.Journal of Microbiology,Immunology and Infection,2010,43（4）:344-346.

［13］潘璠,方蘋,陳輝.羅氏沼蝦幾種病原菌防治藥物的篩選［J］.水產(chǎn)養(yǎng)殖,2007,28（6）:39-41.

［14］陳林,譚愛萍,鄒為民.斑點叉尾致病菌株的鑒定及特性［J］.大連水產(chǎn)學院學報,2009,24（3）:200-205.

［15］胡錢東,林強,石存斌,等.草魚致病性類志賀鄰單胞菌的分離與鑒定［J］.微生物學報,2014,54（1）:229-235.

［16］張新艷,樊海平,曾占壯.草魚致病性類志賀鄰單胞菌的分子鑒定及快速檢測［J］.福建農(nóng)業(yè)學報,2013,28（7）:634-638.

［17］周宇,周秋白.嗜水氣單胞菌防控技術研究進展［J］.生物災害科學,2012,35（1）:126-133,141.

［18］王友娟,李榮峰,李華,等.遼寧地區(qū)養(yǎng)殖淡水魚感染嗜水氣單胞菌的流行病學調(diào)查［J］.中國農(nóng)業(yè)科技導報,2012,14（4）:128-134.

［19］楊永仙.抗生素和中草藥在水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病防治中的作用［J］.云南農(nóng)業(yè),2008（6）:17.

［20］汪黎虹,關瑞章,李忠琴,等.10種單味中藥對養(yǎng)殖鰻鱺主要致病菌的抑制作用［J］.集美大學學報:自然科學版,2010,15（6）:1-5.

［21］張海賓,楊桂芳.12種中草藥對嗜水氣單胞菌殺傷能力的研究［J］.水產(chǎn)科學,2006,25（1）:16-18.

［22］喻鵬飛,趙麗娟,董玲燕,等.姜黃提取物對水產(chǎn)動物病原菌的抑制作用［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學,2016,44（11）:148-150.

［23］張文青,龔一富,金思,等.中草藥及其配伍對嗜水氣單胞菌的抑菌作用［J］.漁業(yè)科學進展,2012,33（1）:114-121.

［24］賴曉健,楊方園,李忠琴.太平洋雙色鰻鱺（Anguilla bicolor pacifica）致病性類志賀鄰單胞菌的鑒定和中藥敏感性研究［J］.海洋與湖沼,2016,47（6）:1185-1192．