徐恒仕 楊英 崔恒祥

[摘要] 目的 研究血小板微RNA（microRNA）基因miR-96-5p在血小板儲(chǔ)存過(guò)程中抗凋亡的機(jī)制，探討血小板儲(chǔ)存時(shí)間的影響因素。 方法 用定量PCR方法檢測(cè)儲(chǔ)存起始和儲(chǔ)存至第5天的健康血液捐獻(xiàn)者的單采血小板中的24種與凋亡相關(guān)的miRNAs的表達(dá)水平的變化，檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，判斷miRNA在調(diào)節(jié)血小板存活或者凋亡方面的作用。 結(jié)果 與儲(chǔ)存起始比較，血小板儲(chǔ)存至第5天miR-96-5p、miR-16-5p、miR-155-5p、miR-148a-5p和miR-296-5p的表達(dá)顯著上升（P < 0.01），而miR-7-5p、miR-145-5p、miR-15a-5p、miR-25-3p以及miR-24-3p的表達(dá)顯著下降（P < 0.01）。轉(zhuǎn)染miR-96-5p抑制物至血小板72 h后，增加了細(xì)胞半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）的活性，抑制了Bcl-2和Bcl-xl的表達(dá)，促進(jìn)了Bax的積累和活性caspase-3的加工。 結(jié)論 miR-96-5p在血小板儲(chǔ)存中可能發(fā)揮抗凋亡作用。

[關(guān)鍵詞] microRNA；miR-96-5p；血小板；抗凋亡；caspase-3

[中圖分類號(hào)] R446.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）02（a）-0013-04

Study of the mechanism of miR-96-5p in anti-apoptosis induced by storage in platelet

XU Hengshi1 YANG Ying1 CUI Hengxiang2

1.Department of Blood Transfusion， Shanghai Ninth People′s Hospital， Shanghai JiaoTong University School of Medicine， Shanghai 201999， China； 2.Shanghai Hanyin Medical Laboratory Ltd. Shanghai 202000， China

[Abstract] Objective To study the anti-apoptosis mechanism of miR-96-5p in platelet during the storage， and explore the factor affecting the platelet storage. Methods The expression changes of apoptosis related 24 miRNAs in apheresis platelets on the starting and 5 days of the storage was detected by quantitative real time PCR， and the results were statistically analyzed. The effect of miRNAs on survival and apoptosis of platelet. Results Compared with the starting of the storage， the expression of miR-96-5p， miR-16-5p， miR-155-5p， miR-148a-5p and miR-296-5p on 5 days of the platelet storage was significantly increased （P < 0.01）， while the expression of miR-7-5p， miR-145-5p， miR-15a-5p， miR-25-3p and miR-24-3p was significantly decreased （P < 0.01）. 72 h after transfected the miR-96-5p inhibitors into the platelet， the activity of caspase-3 was increased and the expression of Bcl-2 and Bcl-xl proteins was decreased， the process of Bax accumulation and active of caspase-3 was promoted. Conclusion miR-96-5p may play a role in the anti-apoptosis of platele storage.

[Key words] microRNA； miR-96-5p； Platelet； Anti-apoptosis； caspase-3

隨著醫(yī)療技術(shù)不斷發(fā)展，臨床用血不足的現(xiàn)象時(shí)常發(fā)生，特別是血小板更是如此，保存時(shí)間短（按現(xiàn)有保存方法，血小板可儲(chǔ)存5 d），因此，改進(jìn)血小板保存技術(shù)是破解這一難題的主要方法之一。作為血液中有形成分之一，血小板是從巨核細(xì)胞胞質(zhì)裂解脫落下來(lái)的具有生物活性的小塊胞質(zhì)，在止血、傷口愈合、炎性反應(yīng)、血栓形成及器官移植排斥等生理和病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。然而，在體外儲(chǔ)存的血小板經(jīng)過(guò)兩個(gè)基本過(guò)程，進(jìn)而決定其質(zhì)量和生命：細(xì)胞凋亡和活化[1]。細(xì)胞凋亡通過(guò)兩個(gè)主要途徑，內(nèi)源性（線粒體）途徑和外在途徑。研究表明，內(nèi)源性途徑調(diào)節(jié)血小板壽命[2]。血小板儲(chǔ)存3 d或更長(zhǎng)時(shí)間后，血小板線粒體呼吸功能和活化反應(yīng)顯著降低[3]。除了線粒體膜去極化引起的呼吸功能降低外，細(xì)胞色素C的釋放，儲(chǔ)存引起的DNA損傷都會(huì)引起血小板的凋亡。內(nèi)源性途徑由Bcl-2家族成員調(diào)節(jié)。Bcl-2家族有兩組，分別為促進(jìn)凋亡和抑制凋亡的家族成員。前者包括Bax和Bak，在凋亡中介導(dǎo)釋放細(xì)胞色素C，促發(fā)凋亡級(jí)聯(lián)?？沟蛲龀蓡T有Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1和Bcl-w等，通過(guò)阻止Bax和Bak活化而維持細(xì)胞活性[4]。

由于血小板缺乏功能核，基因的表達(dá)一般不受DNA轉(zhuǎn)錄或復(fù)制的調(diào)控，而是受到翻譯水平的調(diào)節(jié)。最近的研究已證實(shí)血小板可表達(dá)不同種類的miRNAs[5-6]，這些miRNAs是mRNA的關(guān)鍵翻譯調(diào)控因子。Kannan等[7]報(bào)道了血小板的miRNAs在血小板的凋亡和儲(chǔ)存中發(fā)揮關(guān)鍵作用的研究。

本文旨在研究血小板微RNA（microRNA）基因miR-96-5p在血小板儲(chǔ)存過(guò)程中抗凋亡的機(jī)制，探討血小板儲(chǔ)存時(shí)間的影響因素，具體如下：

1 材料與方法

1.1 單采血小板的制備

單采血小板由上海市第九人民醫(yī)院采集自健康的血液捐獻(xiàn)者，男和女各6名。按照文獻(xiàn)報(bào)道的方法開(kāi)展實(shí)驗(yàn)[8]。采用偶聯(lián)了CD-45、CD-71和CD-235的免疫磁珠（Invitrogen）去除白細(xì)胞、網(wǎng)織紅細(xì)胞和紅細(xì)胞，以獲取血小板。

1.2 MicroRNA提取與qRT-PCR實(shí)驗(yàn)

利用Catch AllTM miRNA & mRNA first strand cDNA 試劑盒的miRNA抽提試劑盒（江蘇昆山彭濟(jì)凱豐生物公司），按說(shuō)明書操作，提取血小板總RNA。提取的總RNA濃度利用Nanodrop分光光度計(jì)（Thermo）根據(jù)OD260數(shù)值來(lái)測(cè)定提取的RNA的濃度。采用mRNA first strand cDNA試劑盒（江蘇昆山彭濟(jì)凱豐生物公司），并按說(shuō)明書展開(kāi)逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。在開(kāi)展逆轉(zhuǎn)錄前樣品保存于-70℃。

總RNA在大腸埃希菌poly-A聚合酶催化下，在每個(gè)miRNA的3'-端產(chǎn)生poly-A尾。然后miRNA的第一條cDNA鏈用poly（T）接頭引導(dǎo)，在42℃條件下催化1 h而成。再利用實(shí)時(shí)定量PCR法（qRT-PCR）測(cè)定（儀器為Mx3005P qPCR System） miRNA的第一條cDNA的含量。經(jīng)過(guò)測(cè)試的成熟miRNA正義鏈序列（http：//microrna. sanger.ac.uk）用作正向序列（見(jiàn)表1），所有的miRNA的表達(dá)檢測(cè)所用的反向引物序列為：5′-GCGAGCACAGAATTAATACGACTC-3′。在qRT-PCR中，用5s rRNA作為內(nèi)參照基因。5s rRNA正向引物序列為5'-TACGGCCATACCACCCTGAA-3'；5s rRNA的反向引物序列為5'-TAACCAGGCCCGACCCTGCT-3'。PCR反應(yīng)條件為：經(jīng)過(guò)95℃ 8 min預(yù)熱，加以下40個(gè)循環(huán)，即95℃孵育15 s，60℃孵育1 min。qRT-PCR結(jié)果用2-ΔΔCt法[ΔΔCt=（Ct靶基-Ct-Ct5s基因）分析。熔鏈曲線用于分析qRT-PCR的擴(kuò)增特異性和質(zhì)量。數(shù)據(jù)用Mxpro software（Mx3005P系統(tǒng)自帶）分析。

1.3 血小板轉(zhuǎn)染

特異性miR-96-5p抑制物和miRNA抑制劑對(duì)照購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因。利用lipo 2000，參考說(shuō)明書將miRNA-96-5p的抑制劑、對(duì)照抑制劑轉(zhuǎn)染到血小板細(xì)胞，轉(zhuǎn)染濃度為200 nmol/L。實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)未做轉(zhuǎn)染的血小板作為空白對(duì)照組。血小板轉(zhuǎn)染72 h后，收集細(xì)胞用于測(cè)定caspase-3的活性或者收集蛋白進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)。

1.4 血小板凋亡評(píng)估實(shí)驗(yàn)

利用DEVD-AFC（AFC為7-氨基-4-三氟甲基香豆素）作為底物分析caspase-3的活性（貨號(hào)K105-100，Biovision）。每組實(shí)驗(yàn)中，（1～5）×106血小板在冰上孵育10 min后，加入含有10 mmol/L二硫蘇糖醇DTT的2×反應(yīng)緩沖液。然后再加入5 μL的1 mmol/L濃度的DEVD-AFC底物，使得底物的終濃度為50 μmol/L。此后將上述細(xì)胞與底物混合液在37℃條件下孵育1～2 h。樣品于96孔酶標(biāo)板中，用含有400 nm激發(fā)光濾光片和505 nm波長(zhǎng)的發(fā)射濾波片的酶標(biāo)儀（SpectraMax M2，Molecular Devices Corporation，USA）測(cè)定。

1.5 免疫印跡實(shí)驗(yàn)

用Western blot法檢測(cè)血小板轉(zhuǎn)染了miR-96-5p抑制物，與相應(yīng)對(duì)照物比較，Bax、Bcl-xl、Bcl-2和caspase-3等凋亡信號(hào)通路蛋白的變化。轉(zhuǎn)染72 h后，取各組血小板（3～5）×107個(gè)，1200×g離心5 min，收集沉淀用PBS洗兩次，用含有蛋白酶抑制劑的SDS裂解液冰上裂解10 min，12 000×g離心5 min，取上清液，經(jīng)過(guò)BCA法定量蛋白濃度后，SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)。電泳后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到甲醇處理過(guò)的硝酸纖維素膜或者PVDF膜上，然后依次加入50 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入相應(yīng)的一抗。所有本研究用到的一抗都為Cell Signal Technology公司抗體，信息下：BAX一抗，貨號(hào)：5023T；Bcl-xl一抗，貨號(hào)：2764T；Bcl-2一抗，貨號(hào)：4223T；caspase-3一抗，貨號(hào)：9661T；所有一抗的稀釋倍數(shù)為1：1000。負(fù)載蛋白的膜與一抗4℃孵育過(guò)夜，經(jīng)洗膜后與酶標(biāo)二抗（Abcam）或者IRDye？誖800CW偶聯(lián)的相應(yīng)的二抗（LI-COR Biosciences）孵育，最后在ECL（Pierce）化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中成像（Bio-Rad ChemiDoc XRS+）或者在Odyssey紅外成像系統(tǒng)（LI-COR Bioscience odysseyTM）中讀取結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血小板儲(chǔ)存5 d對(duì)miRNA表達(dá)的影響

在標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存條件下儲(chǔ)存的血小板，用qRT-PCR的方法，比較儲(chǔ)存了5 d的血小板與儲(chǔ)存0 d的血小板中24個(gè)與凋亡有關(guān)的miRNA的表達(dá)（見(jiàn)表1）[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，在儲(chǔ)存了5 d的血小板中，miR-96-5p、miR-16-5p、miR-155-5p、miR-148a-5p、miR-296-5p顯著上升，與儲(chǔ)存0 d比較，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；而miR-7-5p、miR-145、miR-24-3p、miR-25-3p和miR-15a-5p顯著下降，與儲(chǔ)存0 d比較，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），其中miR-96-5p和miR-16-5p的上升最為顯著（P < 0.01）。見(jiàn)圖1。

2.2 miR-96-5p抑制劑轉(zhuǎn)染到血小板增加了血小板caspase-3活性

天冬酰胺特異酶切的半胱氨酸蛋白酶（caspases）與凋亡效應(yīng)器，細(xì)胞色素C和Bcl-2蛋白家族間相互作用參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控和執(zhí)行，是影響細(xì)胞凋亡的重要因素。其中caspase-3在凋亡的執(zhí)行階段起作用。應(yīng)用檢測(cè)蛋白水解酶活性的手段可以比其他方法更早檢測(cè)到凋亡。caspase-3可以裂解交聯(lián)在底物DEVD上的熒光物質(zhì)AFC使其釋放再通過(guò)熒光比色法檢測(cè)反應(yīng)體系中的熒光強(qiáng)度間接反映蛋白酶的活性。

實(shí)驗(yàn)設(shè)置4組復(fù)孔，設(shè)置未經(jīng)轉(zhuǎn)染的血小板為空白對(duì)照組、轉(zhuǎn)染miRNA抑制物對(duì)照物組為陰性對(duì)照、轉(zhuǎn)染miR-96-5p的為抑制劑組。測(cè)定caspase-3活性[9]的結(jié)果表明，與miRNA抑制劑對(duì)照物比較，200 nmol/L miR-96-5p的抑制劑轉(zhuǎn)染到血小板72 h后，caspase-3的活性顯著上升（P < 0.01）（圖2）。推斷miR-96-5p在血小板中為促進(jìn)細(xì)胞存活的因素，可能在血小板儲(chǔ)存中發(fā)揮抗凋亡作用。

2.3 miR-96-5p抑制劑轉(zhuǎn)染到血小板對(duì)Bax、Bcl-2、BCL-xl和caspase-3表達(dá)的影響

抗凋亡蛋白Bcl-2家族下降和促進(jìn)凋亡的Bax蛋白增加是血小板凋亡常見(jiàn)事件。為進(jìn)一步驗(yàn)證分子水平上miR-96-5p對(duì)凋亡通路的影響，將200 nmol/L的miR-96-5p的抑制劑和抑制劑對(duì)照分別轉(zhuǎn)染到人單采血小板，轉(zhuǎn)染后72 h收集血小板細(xì)胞，采用免疫印跡Western blot的方法分別檢測(cè)各組細(xì)胞中Bcl-2通路相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Bcl-xl和caspase-3的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與抑制劑對(duì)照組細(xì)胞和空白細(xì)胞對(duì)照比較，miR-96-5p的抑制劑轉(zhuǎn)染到血小板細(xì)胞減少了Bcl-2和Bcl-xl的表達(dá)，增加了Bax和caspase-3的表達(dá)（圖3）。轉(zhuǎn)染miR-96-5p抑制劑至血小板，減少了Bcl-2和Bcl-xl的表達(dá)，促進(jìn)了Bax的表達(dá)和caspase-3的表達(dá)。上述結(jié)果表明，隨著血小板儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，其中的miR-96-5p表達(dá)顯著增加，而miR-96-5p的這種增加可能有助于抑制血小板凋亡。

3 討論

目前，血小板的儲(chǔ)存采取的方法是（22±2）℃連續(xù)振搖保存，保存時(shí)間為≤5 d。在保存期間，血小板的生化指標(biāo)逐漸發(fā)生變化，出現(xiàn)一系列形態(tài)、功能和代謝上的改變[3]。近年來(lái)，對(duì)血小板凋亡因素的研究提出了新的研究視角。血小板攜帶了大量的miRNA基因，研究血小板內(nèi)miRNA功能和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在改進(jìn)血小板保存中具有非常重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

資料顯示，一些miRNA，比如miR-326、miR-96-5p、miR-16、miR-155和miR-150等，隨著血小板儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)而出現(xiàn)表達(dá)增加[8]。本研究增加篩查了部分新的與凋亡相關(guān)的miRNA，研究了其在血小板儲(chǔ)存中的變化。結(jié)果顯示，血小板存儲(chǔ)至第5天，miR-96-5p、miR-16-5p、miR-155-5p、miR-148a-5p和miR-296-5p在所有的血小板樣品中都出現(xiàn)增加現(xiàn)象。本研究發(fā)現(xiàn)miR-148a-5p和miR-296-5p是新發(fā)現(xiàn)的隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)而表達(dá)增加的miRNA。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了新的miRNA即miR-24-3p的表達(dá)隨儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)而表達(dá)下降。

筆者對(duì)miR-96-5p在血小板儲(chǔ)存中的作用做了進(jìn)一步研究。資料顯示，miR-96-5p在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用[10-14]。在血小板中，采用miRNA的抑制物，研究miR-96-5p在血小板儲(chǔ)存中對(duì)生存或者凋亡的影響。結(jié)果顯示用miR-96-5p抑制物轉(zhuǎn)染到血小板，能顯著增加血小板的caspase-3的活性，抑制Bcl-2和Bcl-xl的表達(dá)，促進(jìn)Bax的積累和活性caspase-3的加工。根據(jù)這些結(jié)果，推斷miR-96-5p在血小板儲(chǔ)存中起到促進(jìn)存活，抑制血小板凋亡的作用。雖然FOXO1目前較多的被報(bào)道為miR-96-5p的直接調(diào)節(jié)靶基因[15-16]，但miR-96-5p通過(guò)什么樣的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制血小板凋亡將值得進(jìn)一步深入研究。

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（收稿日期：2017-09-24 本文編輯：任 念）