氧化應(yīng)激體外模型的構(gòu)建及沙利度胺保護(hù)作用的研究

高紅亮，吳 超，王 超，程 倩，李 曙

(皖南醫(yī)學(xué)院 病理生理學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002 )

氧化應(yīng)激是指機體在遭受到有害刺激后，機體細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生過多，導(dǎo)致組織和細(xì)胞的損傷[1]。由于氧化應(yīng)激的增強，組織細(xì)胞內(nèi)ROS水平急劇上升，而抗氧化酶如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(Catalase，CAT)等活性降低，使得ROS大量生成積聚，損傷核酸、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)，導(dǎo)致炎癥因子表達(dá)，并觸發(fā)包括平滑肌細(xì)胞增殖和遷移在內(nèi)的多種病理反應(yīng)，甚至引起細(xì)胞凋亡或壞死[2-5]。氧化應(yīng)激與臨床上多種疾病的發(fā)生發(fā)展有著極大的聯(lián)系，如動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展、肺纖維化、癲癇、高血壓等[6]。沙利度胺(反應(yīng)停又名酞胺哌啶酮，Thalidomide)最初作為鎮(zhèn)靜劑治療妊娠嘔吐,因有致畸作用(嬰兒海豹肢)而被禁用。隨著近年來的研究，沙利度胺作為抗血管生成劑和免疫調(diào)節(jié)劑被用于多種疾病的治療[7]，但是在對抗炎癥引起的氧化應(yīng)激損傷中的研究較少，本實驗旨在通過體外炎癥氧化應(yīng)激模型的構(gòu)建，觀察沙利度胺對其的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 沙利度胺購于常州制藥廠，為純品原料藥，將其溶解于二甲基亞砜(DMSO)后得終濃度為50 g/L的母液。四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)試劑盒購于碧云天生物有限公司，脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)(貨號L2880，Sigma公司),凋亡試劑盒(Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)獲于弋磯山醫(yī)院中心實驗室。用DMEM培養(yǎng)基加10%胎牛血清于37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，同時在培養(yǎng)基中加入雙抗(1%青霉素和鏈霉素)共同培養(yǎng)。

1.2.2 MTT實驗 MTT法檢測沙利度胺對于HUVEC的無毒性濃度范圍。消化培養(yǎng)處于對數(shù)生長期的HUVEC，接種在96孔培養(yǎng)板中，保證細(xì)胞密度為1×104/孔，次日待貼壁后，換液，加入沙利度胺終濃度分別為1000、500、250、62、31 mg/L的無血清培養(yǎng)基，每個濃度設(shè)3個副孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后加入MTT( 5g/L) 各20 μL，繼續(xù)在培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后，吸出培養(yǎng)液，將DMSO 150 μL分別加入每孔，搖床上避光輕微振蕩5 min使結(jié)晶紫充分溶解，在酶標(biāo)儀570 nm 波長下測吸光度(C)值。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測最佳造模濃度及時間 LPS濃度設(shè)為4組(0.125、0.25、0.5、1 mg/L)，分別處理HUVEC 6、12、24 h后PBS洗2遍，收集細(xì)胞上清液離心，接著采用0.25%不含EDTA的胰酶消化，制備濃度為1×106個細(xì)胞 /mL的單細(xì)胞懸液，2000 r/min離心5 min，PBS洗滌2次，收集細(xì)胞，用200 μL緩沖液重懸，分別加入5 μL FITC和10 μL PI，4℃避光孵育15 min。用PBS將懸液補充至700 μL，上機檢測。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測LPS不同濃度及時間點的凋亡率。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測沙利度胺最佳預(yù)處理時間 分別用沙利度胺無細(xì)胞毒性的最大濃度預(yù)處理HUVEC 6、12、24 h后直接加入LPS處理，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測沙利度胺不同預(yù)處理時間的凋亡率。

2 結(jié)果

2.1 LPS最佳作用時間及濃度的確定 通過流式細(xì)胞術(shù)測定LPS最佳作用時間及濃度，結(jié)果顯示，較低濃度的LPS(0.25 mg/L,圖1A)即可引起HUVEC的凋亡，且隨著時間的延長，凋亡率逐漸增加(圖1B、C、D)。處理6 h后我們發(fā)現(xiàn)不同濃度組凋亡率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=24.12,P=0.00)，通過兩兩比較，1 mg/L和2 mg/L LPS組與0.25 mg/L、0.5 mg/L LPS組相比，凋亡率升高(P<0.05)，而1 mg/L和2 mg/L LPS組凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在處理12 h時，單因素方差分析不同濃度組凋亡率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=56.34,P=0.00)，SNK法兩兩比較我們發(fā)現(xiàn)2 mg/L LPS的凋亡率最高(P<0.05)，可以達(dá)到80%，但還是不能達(dá)到模型的要求。通過對處理24 h后不同濃度組凋亡率的方差分析(F=42.18,P=0.00)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義后進(jìn)行兩兩比較，1 mg/L LPS處理后24 h的凋亡率和2 mg/L LPS處理24 h后的凋亡率都可以達(dá)到92%左右(圖1E)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。故最終我們選取造模條件為1 mg/L LPS處理24 h。

A～D：0.25、0.5、1、2 mg/L LPS分別作用6、12、24 h；E：不同濃度沙利度胺分別處理6、12、24 h的調(diào)亡率比較。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)測定LPS最佳作用時間及濃度

3.2 沙利度胺無細(xì)胞毒性濃度范圍的確定 通過MTT法測定沙利度胺的無細(xì)胞毒性范圍，結(jié)果顯示，當(dāng)沙利度胺濃度為31、62、125 mg/L時對細(xì)胞基本是無毒性作用的(P>0.05，vs. Control)，故最終確定沙利度胺無細(xì)胞毒性濃度范圍為0～100 mg/L。見圖2。

圖2 不同濃度沙利度胺對HUVEC活力的影響

3.3 沙利度胺最佳干預(yù)時間的確定 通過流式細(xì)胞術(shù)測定100 mg/L沙利度胺最佳預(yù)處理時間，方差分析不同干預(yù)組凋亡率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=13.12,P=0.00)，兩兩比較結(jié)果顯示，與模型組凋亡率(91.6%)相比，沙利度胺預(yù)處理6 h(43.26%)、12 h(44.29%)、24 h(43.71%)的凋亡率均明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但是沙利度胺預(yù)處理組各之間凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。故確定用沙利度胺預(yù)處理6 h。見圖3。

3.4 不同濃度沙利度胺保護(hù)作用的比較 通過流式細(xì)胞術(shù)測定不同濃度沙利度胺對氧化應(yīng)激的保護(hù)作用。方差分析不同濃度組凋亡率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=52.12,P=0.00)，兩兩比較結(jié)果顯示，與模型組凋亡率(75.74%)相比，沙利度胺1 mg/L(68.62%)，10 mg/L(52.66%)，100 mg/L(23.04%)預(yù)處理組均表現(xiàn)出了不同程度的保護(hù)作用，其中100 mg/L沙利度胺預(yù)處理組凋亡率與1 mg/L，10 mg/L預(yù)處理組相比，凋亡率下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

1：空白對照組；2：模型組；3：沙利度胺單獨作用組；4～6：100 mg/L沙利度胺預(yù)處理6、12、24 h后LPS作用24 h。

圖3 沙利度胺預(yù)處理不同時間點對HUVEC凋亡率的影響

1：空白對照組；2：模型組；3～5：1、10、100 mg/L沙利度胺預(yù)處理6 h后LPS作用24 h。

圖4 不同濃度沙利度胺保護(hù)作用的比較

4 討論

在很多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中，氧化應(yīng)激損傷都參與了其中的反應(yīng)。血管內(nèi)皮細(xì)胞在維持血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起到重要的屏障作用，但是由于氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生，首先受到損傷的便是內(nèi)皮細(xì)胞，而氧化應(yīng)激反應(yīng)所產(chǎn)生的ROS是導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的主要因素[8-11]。而心血管疾病發(fā)生與發(fā)展的最主要原因便是炎癥。有研究表明，動脈粥樣硬化斑塊的形成與凋亡的內(nèi)皮細(xì)胞存在著很大的聯(lián)系。故通過體外構(gòu)建炎癥模型來探討炎癥發(fā)生時內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)方法顯得尤為重要。LPS是革蘭陰性細(xì)菌外璧層中特有的一種化學(xué)成分，能夠刺激體內(nèi)多種細(xì)胞合成和釋放眾多內(nèi)源性生物活性因子,導(dǎo)致全身性炎癥反應(yīng)發(fā)生,由此引起中毒性休克、全身炎癥反應(yīng)綜合征和多器官功能障礙綜合征[12-13]，用于多種體外炎癥模型的構(gòu)建。而由于近年來沙利度胺在臨床上的廣泛應(yīng)用，大家也把目光聚集在沙利度胺是否能夠通過抑制炎癥反應(yīng)來減少氧化應(yīng)激損傷時內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。故本研究希望用LPS構(gòu)建體外炎癥的模型來探討沙利度胺的抗氧化應(yīng)激的效果，但是由于各個實驗室的藥品、細(xì)胞培養(yǎng)條件等的差異，我們需要篩選出適合本實驗室研究的模型條件。通過流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果顯示，低濃度的LPS即可引起HUVEC的凋亡，但是并不能達(dá)到炎癥模型的要求，最后發(fā)現(xiàn)在相同時間點0.25、0.5 mg/L LPS處理后的凋亡率基本沒有改變，但是1 mg/L LPS在處理24 h后的凋亡率可以達(dá)到92%，另外在各個時間點2 mg/L LPS與1 mg/L LPS處理后的凋亡率基本相同。故最終確定LPS造模濃度為1 mg/L,時間為24 h。此外為了確定沙利度胺在發(fā)生炎癥和氧化應(yīng)激損傷時的保護(hù)作用，我們首先篩選了沙利度胺的無細(xì)胞毒性的濃度范圍，確定其無細(xì)胞毒性濃度范圍

為0～125 mg/L。此外我們還測定了沙利度胺的最佳預(yù)處理時間，100 mg/L沙利度胺分別預(yù)處理6、12、24 h后，再加入1 mg/L LPS處理24 h后測定其凋亡率，結(jié)果顯示，預(yù)處理6、12、24 h之間的凋亡率沒有明顯變化，但是與模型組相比，凋亡率降低。之后我們又測定了不同濃度的沙利度胺對于LPS引起的氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)隨著沙利度胺濃度的提高，凋亡率下降，說明沙利度胺在氧化應(yīng)激反應(yīng)損傷中起到了保護(hù)作用，且與濃度呈正相關(guān)。

綜上，我們確定了LPS體外炎癥模型的建立和沙利度胺的預(yù)處理時間和濃度，為在炎癥發(fā)生時尋求更好的保護(hù)方式提供了更好的思路，同時也為沙利度胺更好地服務(wù)于臨床打下了理論基礎(chǔ)。但是沙利度胺具體的保護(hù)機制還有待進(jìn)一步的研究。

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