鄧玉營(yíng)，阮文權(quán)，郁 莉，黃一波

（1.常州工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 常州 213164；2.江南大學(xué)環(huán)境與土木工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

秸稈是農(nóng)業(yè)有機(jī)廢棄物的主要來(lái)源，受技術(shù)的制約，現(xiàn)階段綜合利用效率不高。厭氧消化被認(rèn)為是秸稈資源化的重要途徑，秸稈的半纖維素、纖維素等成分被用于產(chǎn)生沼氣，而且可以獲得沼渣沼液肥，綜合效益顯著。但秸稈復(fù)雜的結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其較難水解，是厭氧消化的主要限速過(guò)程[1]。瘤胃微生物被認(rèn)為是高效的秸稈纖維素降解者，其中瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌（Fibrobacter succinogenes）等水解菌發(fā)揮了重要作用[2－3]，常用于瘤胃接種秸稈的厭氧消化[4－6]。

瘤胃微生物群落中僅含有少量的嗜氫型產(chǎn)甲烷菌[7]，揮發(fā)性脂肪酸（VFAs）主要通過(guò)瘤胃上皮細(xì)胞吸收。但在厭氧消化中水解產(chǎn)生的VFAs易造成積累，導(dǎo)致pH值下降，水解活性受到抑制[4－5]。研究表明，pH值會(huì)形成不同的生態(tài)位，為微生物提供最適的生長(zhǎng)環(huán)境。如水解菌最適pH值范圍在5.3～8.3之間[8]；甲烷菌的最適pH值生態(tài)幅度比水解菌要窄，在6.5～8.2之間[9]，低于6.2會(huì)對(duì)甲烷菌產(chǎn)生毒害作用[1]。因此調(diào)控pH值在適宜的范圍內(nèi)有利于水解和產(chǎn)甲烷活性的提高，如Yang等[10]研究表明，高固態(tài)餐廚垃圾厭氧消化中提高pH值可強(qiáng)化水解酶和產(chǎn)甲烷活性。在以往的研究中嘗試了瘤胃接種體系投加甲烷菌來(lái)減少VFAs積累[6]；但在厭氧消化體系通過(guò)調(diào)控pH改變功能菌群結(jié)構(gòu)和豐度，以提高秸稈轉(zhuǎn)化效率的研究鮮有相關(guān)報(bào)道。

研究表明，秸稈降解體系常利用16S rDNA來(lái)分析菌群變化[11]，但功能基因的檢測(cè)更具應(yīng)用價(jià)值[3，12－13]。研究者將糖苷酶和酯酶按照活性中心氨基酸序列的差異劃分為不同的水解酶（GH）家族，從Cazy數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的情況來(lái)看，GH 5、GH 9、GH 45和 GH 48包含了大多數(shù)厭氧纖維素酶。瘤胃的纖維素水解菌（如Bacteroides、Clostridium、Ruminococcus和 Fibrobacter）含有GH 5基因[3，13]，能用于水解菌的分析檢測(cè)。甲烷菌中甲基輔酶M轉(zhuǎn)移酶（mcrA）是產(chǎn)甲烷途徑中從甲基四氫甲烷蝶呤到甲基輔酶M的關(guān)鍵酶，基因數(shù)量的變化可以用于表征產(chǎn)甲烷活性高低[14]。

為此，本研究通過(guò)添加緩沖液來(lái)調(diào)控pH值，為功能菌群提供適宜的生長(zhǎng)環(huán)境，減少中間代謝產(chǎn)物的抑制，強(qiáng)化稻秸降解以及產(chǎn)甲烷活性。通過(guò)MiSeq高通量測(cè)序進(jìn)行菌群豐度分析；采用相對(duì)定量PCR（QPCR）檢測(cè)GH 5和mcrA基因來(lái)分析水解菌及產(chǎn)甲烷菌的變化，從而探索pH調(diào)控對(duì)功能菌群及厭氧消化特性的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)原料

從無(wú)錫某屠宰場(chǎng)收集成年黃牛的瘤胃消化物，通過(guò)兩層紗布過(guò)濾掉未消化的草料獲得瘤胃液接種物，其總固體含量（TS）和揮發(fā)性固體含量（VS）分別為2.28%和1.32%，初始pH值為6.81，碳氮比為12.48，儲(chǔ)存在4℃冰箱中并在3 h內(nèi)完成實(shí)驗(yàn)。稻秸從江蘇徐州地區(qū)稻田收割后購(gòu)得，50℃烘箱中干燥，使用粉碎機(jī)（湖南中誠(chéng)制藥機(jī)械廠，中國(guó)）粉碎過(guò)40目篩后，儲(chǔ)存在密封袋中備用，其TS、VS及碳氮比分別為93.74%、84.62%和43.15。

1.2 實(shí)驗(yàn)裝置

實(shí)驗(yàn)在2 L有效容積的機(jī)械攪拌裝置中進(jìn)行，操作原理如圖1所示。瘤胃液接種物使用去離子水稀釋5倍后補(bǔ)入反應(yīng)體系中。使用NaHCO（35.00 g·L－1）及K2HPO4·3H2O（1.34 g·L－1）、KH2PO（40.51 g·L－1）組成雙效緩沖液，調(diào)整pH值為6.8～7.1。整個(gè)厭氧消化在（39±1）℃和 60 r·min－1條件下運(yùn)行。包括三個(gè)階段，每個(gè)階段運(yùn)行 16 d，有機(jī)負(fù)荷分別為 1.5、3.5 g·L－1·d－1和 7 g·L－·1d－1。每 4 d 添加稻秸前，排出沼渣沼液；調(diào)控體系中用上述緩沖液補(bǔ)充沼液，對(duì)照處理則使用去離子水補(bǔ)充。通過(guò)鋁塑袋收集氣體并進(jìn)行各組分含量分析，將量筒口浸入水中，通過(guò)排出水的量來(lái)測(cè)定沼氣體積。每個(gè)階段收集樣品提取DNA，用于相對(duì)QPCR分析，瘤胃接種物和消化結(jié)束時(shí)樣品同時(shí)進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 理化指標(biāo)

圖1 半連續(xù)反應(yīng)裝置示意圖Figure 1 Schematic diagram of the semi－continuous reactor

收集的沼液通過(guò)兩層紗布過(guò)濾后，濾液在12 000 r·min－1離心 10 min，上清液用于 pH、VFAs和酶活性測(cè)定。pH用DELTA 320 pH計(jì)（梅特勒－托利多儀器，美國(guó)）測(cè)定。VFAs使用GC－2010 Plus氣相色譜（島津，日本）分析，進(jìn)樣器和檢測(cè)器程序設(shè)定參考Liu等[15]的方法。水解酶通過(guò)濾紙酶（FPase）和羧甲基纖維素酶（CMCase）來(lái)表征，參考以前的方法測(cè)定[6]。1個(gè)酶活力單位定義為每毫升每分鐘上清液釋放1 μg葡萄糖的酶量。氣體成分使用GC－2014氣相色譜（島津，日本）分析。

1.3.2 相對(duì)Q－PCR

分別利用總細(xì)菌通用性基因[14]、GH 5水解家族基因[12]及甲烷菌mcrA基因[14]的引物對(duì)進(jìn)行相對(duì)QPCR實(shí)驗(yàn)，使用SYBRPremixExTaqTMⅡ試劑（RR820A，大連寶生物，中國(guó)）構(gòu)建PCR體系，引物終濃度為0.2 μmol·L－1、DNA 模板為 20ng。每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3 次，程序按Step One PCR儀操作說(shuō)明自動(dòng)采集熒光[12，14]，得到目標(biāo)基因的閾值（CT）。將總菌通用基因設(shè)為內(nèi)標(biāo)基因，定量分析GH 5水解微生物以及甲烷菌相對(duì)于起始接種物的變化。每個(gè)階段樣品與接種物的變化量利用 2－ΔΔCT法確定，ΔΔCT值為每個(gè)階段目標(biāo)菌的 CT值和總菌CT值的差值與接種物中兩個(gè)CT值相減的結(jié)果。按照定義最初接種物的2－ΔΔCT設(shè)定為1，目標(biāo)菌的變化量用增長(zhǎng)或減少的倍數(shù)來(lái)表示[16]。

1.3.3 菌群豐度分析

引物對(duì)515F和806R對(duì)16S的V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，利用MiSeq（Illumina公司，美國(guó)）技術(shù)進(jìn)行測(cè)序，原始序列參考以前的方法分析[6]，經(jīng)拼接后加工處理，按照97%相似度進(jìn)行聚類(lèi)分析，物種注釋及菌群組成變化用相對(duì)豐度表示。原始序列提交到NCBI中的SRA，序列號(hào)為SRP123714。

1.4 數(shù)據(jù)處理

通過(guò)SPSS 19.0中的單因素方差（ANOVA）單元進(jìn)行差異顯著性分析，閾值水平設(shè)為0.05。使用O－riginPro 8.5軟件繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 厭氧消化特性

2.1.1 產(chǎn)沼氣和甲烷變化

如圖2所示，調(diào)控體系中的沼氣產(chǎn)率在83.33～343.33 mL·L－1·d－1范圍內(nèi)變動(dòng)。沼氣產(chǎn)率逐漸增加，在40 d時(shí)達(dá)到最大值，隨后產(chǎn)率有所下降。對(duì)照體系中甲烷含量變化范圍為16%～27%，呈下降趨勢(shì)；調(diào)控體系的甲烷含量在24%～32%之間變動(dòng)，提高顯著（P＜0.05）。經(jīng)計(jì)算三個(gè)階段的甲烷產(chǎn)率均值分別達(dá)到了36.87、58.00 mL·L－1·d－1和 79.24 mL·L－1·d－1，和對(duì)照體系相比均顯著提高（P＜0.05），分別提高了1.98、1.99倍和1.53倍（表1）。

在接種瘤胃厭氧消化實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，甲烷的含量不超過(guò)19.6%[4－5]，和本研究對(duì)照體系所得結(jié)論一致。主要是因?yàn)榱鑫附臃N物中缺少產(chǎn)甲烷菌，造成秸稈降解產(chǎn)生的VFAs積累，并導(dǎo)致pH值下降，抑制產(chǎn)甲烷菌活性[5]。而調(diào)控體系保證了最適的pH值范圍，有利于甲烷菌活性的提高。如Yang等[10]在高固態(tài)餐廚垃圾厭氧消化研究中，調(diào)控pH值為8，提高了水解酶（如淀粉酶和蛋白酶）的活性，并激活了嗜氫型產(chǎn)甲烷菌中的輔酶F420，使甲烷產(chǎn)率和含量分別達(dá)到了171.0 mL·g－1TS 和 53.1%。Deng 等[6]在秸稈厭氧消化中，通過(guò)甲烷菌強(qiáng)化使pH值在6.91以上，有效減少了VFAs積累，使甲烷產(chǎn)率明顯提高。

2.1.2 體系中pH值和VFAs濃度的變化

圖2 厭氧消化過(guò)程中沼氣產(chǎn)率和甲烷含量的變化Figure 2 The biogas production rates and methane contents during anaerobic digestion

表1 三個(gè)階段消化參數(shù)（沼氣和甲烷產(chǎn)率、VFAs總濃度及pH值）的變化Table 1 The digestion parameters of the biogas and methane yields，total VFAs concentrations and pH values during the three stages

VFAs作為厭氧消化中間產(chǎn)物，能夠表征過(guò)程中產(chǎn)酸和產(chǎn)甲烷之間的動(dòng)態(tài)平衡。對(duì)照體系三個(gè)階段VFAs總濃度分別為 3.89、2.82 g·L－1和 4.63 g·L－1；而調(diào)控體系 VFAs濃度分別達(dá)到了 2.97、2.86 g·L－1和5.52 g·L－1，差異不顯著（表 1）。VFAs濃度的變化如圖3所示，乙酸和丙酸是主要組分，濃度分別在1.32～3.08 g·L－1和 1.12～1.76 g·L－1之間變動(dòng)，兩者比例先減少后逐漸增大。相比之下，對(duì)照體系中乙酸和丙酸濃度分別在 1.37～2.91 g·L－1和 1.15～1.72 g·L－1之間，而丁酸在第一和第三階段均有積累，均值分別為0.70 g·L－1和 0.99 g·L－1。如表 1 所示，受到 VFAs積累的影響，對(duì)照體系pH值降至6.08～7.01之間；而調(diào)控體系在三個(gè)階段均顯著提高（P＜0.05），pH 值在 6.24～7.77之間變動(dòng)，均值達(dá)到了7.14，處于最適產(chǎn)甲烷范圍內(nèi)[9]。

圖3 消化過(guò)程中pH值和單個(gè)VFA濃度的變化Figure 3 The changes of pH values and individual VFA during the anaerobic digestion

當(dāng)有機(jī)負(fù)荷提高為 7 g·L－1·d－1，調(diào)控體系中單個(gè)VFAs的積累造成pH值下降，最低達(dá)到了6.24。根據(jù)Lerm等[17]的研究，隨著有機(jī)負(fù)荷升高，代謝產(chǎn)生的氫和還原力NADH來(lái)不及被甲烷菌利用時(shí)會(huì)產(chǎn)生丙酸（或丁酸），這是厭氧消化受抑制的重要標(biāo)志；而乙酸經(jīng)過(guò)短暫積累后可以被甲烷菌所利用。本研究中調(diào)控使pH值在適宜的范圍內(nèi)，乙酸和丙酸之間比例逐漸升高，有利于產(chǎn)甲烷代謝。如Deng等[6]在稻秸瘤胃接種體系中同樣發(fā)現(xiàn)，乙酸能被用于產(chǎn)甲烷，其濃度和甲烷產(chǎn)率呈正比。而另一個(gè)稻秸厭氧消化研究表明，瘤胃液預(yù)處理超過(guò)48 h后，丙酸的積累是造成甲烷產(chǎn)率下降的主要原因[5]。

2.1.3 秸稈纖維素水解活性

CMCase和FPase常被用于衡量纖維素水解酶活的變化，三個(gè)階段的變化如圖4所示。調(diào)控體系中CMCase 酶活分別在 0.24～0.72、0.87～1.10 U·mL－1和1.37～2.23 U·mL－1范圍內(nèi)變動(dòng)。FPase酶活變化范圍為0.19～0.35、0.54～0.98U·mL－1和 0.61～0.98U·mL－1，呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。CMCase和FPase酶活都比對(duì)照樣品顯著提高（P＜0.05），這也體現(xiàn)出調(diào)控體系的水解優(yōu)勢(shì)。首先，pH值高低影響纖維素水解，如Romsaiyud等[8]發(fā)現(xiàn)低pH值會(huì)對(duì)纖維素水解菌產(chǎn)生離子毒性，抑制水解酶的產(chǎn)生；而Hu等[4]在接種瘤胃研究中表明，通過(guò)提高pH值能增加纖維素降解的效率。其次，纖維素的降解需要各類(lèi)微生物協(xié)同作用[6]，調(diào)控體系為甲烷菌提供了適宜的pH值，加快了功能菌群種間氫傳遞，水解和產(chǎn)甲烷活性都能得到明顯提高。

2.2 菌群相對(duì)豐度的變化

利用MiSeq測(cè)序分析了接種物和消化結(jié)束時(shí)樣品中菌群相對(duì)豐度的變化，包括細(xì)菌和甲烷菌兩類(lèi)。如圖5a所示，細(xì)菌中擬桿菌目（Bacteroidales）和梭菌目（Clostridiales）相對(duì)豐度較高，而伯克氏菌目（Burkholderiales）和芽胞桿菌目（Bacillales）厭氧消化結(jié)束后消失?；I(yíng)菌目（Synergistales）常與甲烷菌形成互營(yíng)氧化菌群[18]，相對(duì)豐度升高表明了調(diào)控體系中協(xié)同作用的增強(qiáng)。

在調(diào)控體系中，發(fā)酵產(chǎn)酸微生物Bacteroidales的相對(duì)豐度從29.73%下降到23.31%[11]，但在對(duì)照體系中則升高為37.37%。Clostridiales相對(duì)豐度從13.29%升高到60.48%，研究發(fā)現(xiàn)該目是秸稈及纖維素底物重要的水解菌[13]，如梭狀芽孢桿菌屬（Clostridium）和Ruminococcus[2-3]。Clostridium是秸稈纖維素的主要降解者[19]；Ruminococcus在瘤胃內(nèi)纖維素降解中發(fā)揮重要作用，但在人工反應(yīng)器中很少被檢測(cè)到。而本研究調(diào)控體系中盡管Clostridium相對(duì)豐度為21.18%，但是Ruminococcus的含量提高了12.47倍，而來(lái)源瘤胃的另一種水解菌Fibrobacter則從體系中消失（圖5b）。

圖4 厭氧消化過(guò)程中羧甲基纖維素酶和濾紙酶活性的變化Figure 4 The changes of the CMCase and FPase activities during anaerobic digestion

瘤胃中甲烷菌類(lèi)型主要以嗜氫型甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter）為主[3，7]。如圖 5c 所示，本研究接種物中Methanobrevibacter豐度達(dá)到了0.87%。厭氧消化結(jié)束后，在調(diào)控體系中Methanobrevibacter相對(duì)豐度升高到了3.73%，而甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）的相對(duì)豐度為0.07%。在對(duì)照體系中，Methanobrevibacter比例降低，無(wú)Methanosarcina存在。Methanosarcina能夠利用體系中產(chǎn)生的乙酸，在秸稈水解體系中發(fā)揮重要作用[6，10]。產(chǎn)甲烷菌群的變化表明，pH調(diào)控體系不僅提高了嗜氫型Methanobrevibacter比例，也增加了嗜乙酸型甲烷菌相對(duì)豐度，對(duì)產(chǎn)甲烷活性的提高起到了關(guān)鍵作用。

圖5 厭氧消化后菌群相對(duì)豐度的變化Figure 5 Changes of relative abundances on the microbial communities after anaerobic digestion

2.3 GH 5水解和甲烷菌的變化

GH 5 水解菌群在厭氧體系中分布廣泛[3，12－13]，Sun等[13]發(fā)現(xiàn)，GH 5基因含量的變化能用于研究秸稈或纖維素降解的效率。如圖6a所示，本研究利用GH 5基因表征纖維素水解菌，調(diào)控體系的變化趨勢(shì)為先降低后升高，最后趨于穩(wěn)定，厭氧消化結(jié)束時(shí)比接種時(shí)提高了1.65倍。水解菌開(kāi)始階段的減少可以用Russell等[2]的研究結(jié)論來(lái)解釋?zhuān)鑫肝⑸镫x開(kāi)生境后，環(huán)境條件的改變使部分水解菌無(wú)法適應(yīng)而從人工裝置中消失。對(duì)照體系中的水解菌數(shù)量整個(gè)過(guò)程變化不大。甲烷菌的變化如圖6b所示，和瘤胃接種物相比，pH調(diào)控使甲烷菌先降低后升高，最后增加了0.57倍；而對(duì)照中甲烷菌明顯減少。甲烷菌數(shù)量的變化也解釋了不同反應(yīng)裝置中沼氣產(chǎn)率和甲烷含量的差異。

圖6 功能菌群的變化特征Figure 6 The change characteristics of the function consortia

瘤胃中水解菌和嗜氫型甲烷菌存在種間氫傳遞。白色瘤胃球菌（Ruminococcus albus）通過(guò)糖酵解中丙酮酸氧化途徑獲得NADH用于產(chǎn)H2，H2被利用得到乙醇。但當(dāng)H2被利用產(chǎn)甲烷后，實(shí)現(xiàn)了NAD+的再生，產(chǎn)乙酸成為主要代謝類(lèi)型[20]。如Ruminococcus albus 7降解微晶纖維素時(shí)，加入Methanobrevibacter smithii PS后，產(chǎn)甲烷效率提高[21]。黃化瘤胃球菌（Ruminococcus flavefaciens）產(chǎn)生的還原型輔酶NADH既能用于產(chǎn)琥珀酸又能用于產(chǎn)H2，通過(guò)種間氫傳遞給甲烷菌后，產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸途徑得到強(qiáng)化。如添加Methanobacterium ruminantium PS到R.flavefaciens C94降解纖維素體系中，使產(chǎn)生的乙酸與琥珀酸比例提高了15倍[22]。Piao等[23]同樣發(fā)現(xiàn)了Methanobrevibacter在牛瘤胃的柳枝稷消化中發(fā)揮了重要作用，增強(qiáng)了降解效果。研究還表明，甲烷菌活性受到抑制，會(huì)影響到功能菌群的活性，使水解菌含量下降。如Lazuka等[24]在小麥秸厭氧消化研究中，添加溴乙基磺酸鈉（BES）抑制甲烷菌后，來(lái)源于瘤胃的Ruminococcus從體系中消失。本研究pH調(diào)控提高了甲烷菌的活性，Methanobrevibacter含量升高，可以與瘤胃水解菌Ruminococcus形成功能菌群，加快了種間氫傳遞，從而使水解和產(chǎn)甲烷活性都得到了提高。

秸稈厭氧消化研究發(fā)現(xiàn)，可以通過(guò)強(qiáng)化嗜乙酸型產(chǎn)甲烷途徑來(lái)降低VFAs積累現(xiàn)象。如Wang等[25]在青貯牧草降解中，發(fā)現(xiàn)纖維素降解產(chǎn)生的乙酸刺激了Methanosarcina在固渣表面的生長(zhǎng)，從而加快了底物的降解。Miller等[21]利用瘤胃水解菌Ruminococcus albus和Methanobrevibacter降解微晶纖維素時(shí)，再投入嗜乙酸型Methanosarcina barkeri，乙酸利用率提高到88%，強(qiáng)化了甲烷產(chǎn)率；而沒(méi)有與甲烷菌共消化時(shí)，易造成VFAs積累。在稻秸厭氧消化中，Deng等[6]嘗試通過(guò)瘤胃液和活性污泥共接種稻秸厭氧消化策略，發(fā)現(xiàn)來(lái)源于污泥的甲烷菌有利于乙酸產(chǎn)甲烷代謝。并且發(fā)現(xiàn)在稻秸干式發(fā)酵中，甲烷菌菌群結(jié)構(gòu)和數(shù)量的變化會(huì)影響產(chǎn)甲烷效率[26]。本研究中Methanosarcina相對(duì)豐度僅為0.07%，易造成乙酸的短暫積累。因此，在pH調(diào)控強(qiáng)化瘤胃液接種秸稈厭氧消化中，需要提高嗜乙酸甲烷菌的含量，來(lái)解除發(fā)酵產(chǎn)物中VFAs的積累，進(jìn)一步增強(qiáng)產(chǎn)甲烷效率。

3 結(jié)論

（1）與對(duì)照相比，pH調(diào)控使甲烷產(chǎn)率分別提高了1.98、1.99倍和1.53倍，甲烷含量在24%～32%之間變動(dòng)。VFAs濃度中乙酸和丙酸分別在1.32～3.08 g·L－1和1.12～1.76 g·L－1之間變動(dòng)，比值逐漸增大；pH 值維持在6.24～7.77之間。

（2）調(diào)控體系秸稈纖維素水解活性提高，CMCase和FPase酶活呈增加趨勢(shì)，分別在0.24～2.23 U·mL－1和 0.19～0.98 U·mL－1之間變動(dòng)。

（3）微生物菌群分析表明，調(diào)控體系中Bacteroidales和Clostridiales目成為優(yōu)勢(shì)菌群；來(lái)源于瘤胃的Burkholderiales和Bacillales目從體系中消失。Clostridiales的Clostridium仍是優(yōu)勢(shì)菌屬（21.18%），但Ruminococcus的比例提高了12.47倍，F(xiàn)ibrobacter從體系中消失。

（4）調(diào)控體系中嗜氫型 Methanobrevibacter相對(duì)豐度從 0.87%提高到3.73%，成為優(yōu)勢(shì)菌屬；嗜乙酸型Methanosarcina相對(duì)豐度增加至0.07%。

（5）功能菌群相對(duì)Q－PCR分析表明，pH調(diào)控使GH 5水解菌群提高了1.65倍，甲烷菌提高了0.57倍。

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