董煒靈，尹華群*，劉學(xué)端，宋阿琳，范分良*

(1.中南大學(xué)資源加工與生物工程學(xué)院，湖南 長沙 410000；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所/農(nóng)業(yè)部植物營養(yǎng)與肥料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081)

近年來，全球氣候變化在改變生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能方面已經(jīng)發(fā)揮了越來越重要的作用。由于土壤微生物群落介導(dǎo)了絕大多數(shù)土壤功能過程，因而氣候變化所導(dǎo)致的溫度上升會(huì)通過影響微生物群落結(jié)構(gòu)和活性進(jìn)而間接影響土壤功能[1-2]，其中包括土壤營養(yǎng)物質(zhì)的流動(dòng)和碳氮等元素的生物地球化學(xué)循環(huán)[3-5]。然而，鑒于土壤微生物群落高度復(fù)雜的多樣性，目前人們還難以了解溫度升高是如何影響土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能以及其對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)的反饋[6]。相比于植物和動(dòng)物對(duì)于溫度變化的響應(yīng)，微生物在這方面的研究相對(duì)要少一些，而真菌比細(xì)菌則更少。微生物中真菌更偏向于降解那些以難降解碳形式居多的有機(jī)碳化合物[7]。微生物群落豐度在溫度轉(zhuǎn)變下所發(fā)生的變化反映出其溫度敏感性，研究真菌群落的溫度敏感性有助于了解土壤中難降解碳的降解情況和趨勢(shì)。

另一方面，人類活動(dòng)例如牧場(chǎng)和農(nóng)田的建立，或者人工造林都會(huì)對(duì)土壤性質(zhì)產(chǎn)生不同程度的影響[8]。而土壤性質(zhì)的改變可能關(guān)聯(lián)到土壤微生物的溫度敏感性。然而，對(duì)于改變土壤性質(zhì)對(duì)土壤微生物溫度敏感性產(chǎn)生影響的相關(guān)研究還很少。本研究以湖南省祁陽縣兩種不同性質(zhì)的紅壤為研究對(duì)象，利用伽馬射線滅菌和土壤互相接種的方式探討改變土壤性質(zhì)對(duì)土壤真菌溫度敏感性的影響，旨在為全球氣候變暖情況下不同土壤溫度敏感性相關(guān)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

供試土壤取自湖南省祁陽縣中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)站(26°45′12″ N，111°52′32″ E)，成土母質(zhì)為第四紀(jì)紅土，年平均氣溫18℃，年降水量1 250 mm。其中自然土壤取自長期定位施肥試驗(yàn)田附近，農(nóng)田土壤取自長期定位施肥試驗(yàn)田。供試土壤的主要化學(xué)性質(zhì)見表1。

表1 供試土壤的主要化學(xué)性質(zhì)

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以往研究表明，盡管伽馬射線滅菌可能提高土壤銨態(tài)氮濃度，但其對(duì)土壤性質(zhì)的總體影響比高溫高壓滅菌等其它滅菌方法的影響要小[9]，故本研究利用伽馬射線將兩種性質(zhì)的土壤(自然土和農(nóng)田土)滅菌，滅菌劑量為40 kGy。然后分別裝袋，每袋土為1.4 kg。后將100 g未滅菌的土壤(自然土和農(nóng)田土)分別裝入已滅過菌的不同性質(zhì)土壤(自然土和農(nóng)田土)中。其中，滅菌土壤提供特定的土壤性質(zhì)(一種是未施肥處理性質(zhì)的土壤，另一種是經(jīng)過長期施肥處理性質(zhì)的土壤)，而未滅菌土壤提供兩種土壤特定的微生物。因此，本試驗(yàn)分為4個(gè)處理：(1)未滅菌自然菌+滅菌自然土，(2)未滅菌自然菌+滅菌農(nóng)田土，(3)未滅菌農(nóng)田菌+滅菌農(nóng)田土，(4)未滅菌農(nóng)田菌+滅菌自然土。本試驗(yàn)主要研究：(1)自然土壤微生物在自然和農(nóng)田兩種土壤性質(zhì)下溫度敏感性對(duì)比；(2)農(nóng)田土壤微生物在農(nóng)田和自然兩種土壤性質(zhì)下溫度敏感性對(duì)比。將土壤混勻后用無菌濾膜密封，以防微生物污染，但可以流通空氣，然后放于20℃預(yù)培養(yǎng)一個(gè)月。

預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后，將30 g土壤分裝于125 mL血清瓶中，分別于15和25℃正式培養(yǎng)20 d。分別在培養(yǎng)的第2、5、10、15 d打開蓋子，讓瓶內(nèi)氣體與室內(nèi)環(huán)境氣體換氣5 min。20 d后，破壞性取樣，把土壤存放于-80℃冰箱。

1.3 測(cè)試方法

1.3.1 土壤DNA的提取

采用DNA提取試劑盒FastDNA spin kit for soil(MP Biomedicals)，按照說明書的步驟操作。

1.3.2 定量PCR擴(kuò)增

擴(kuò)增真菌18S rDNA的引物為真菌通用引物FF390和FR1，它們的序列為：

FF390：5′-CGATAACGAACGAGACCT-3′和FR1：5′-AICCATTCAATCGGTAIT-3′

反應(yīng)體系見表2。

表2 總體積15 μL的定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃解鏈10 s，52℃退火30 s；72℃延伸45 s；40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

1.3.3 普通PCR

擴(kuò)增真菌ITS DNA采用兩輪擴(kuò)增法，第一輪引物為真菌通用引物ITS1F和ITS4，第二輪引物為真菌通用引物ITS4和帶有barcode的引物ITS3，它們的序列為：

ITS1F：5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′

ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC -3′

ITS3：5′-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3′

反應(yīng)體系見表3。

表3 總體積25 μL的普通PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系

第一輪PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃解鏈45 s，50℃退火30 s；72℃延伸1.5 min；30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

第二輪PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃解鏈45 s，50℃退火30 s；72℃延伸1.5 min；30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物跑1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.3.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物切膠純化和回收

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化和回收，使用天根DNA切膠純化試劑盒，按照說明書的步驟操作。

1.3.5 高通量測(cè)序

采用Illumina第二代測(cè)序技術(shù)平臺(tái)。

1.4 分析工具與方法

1.4.1 分析工具

高通量序列用USEARCH軟件包分析，首先去除質(zhì)量數(shù)低于20的序列，然后去除與引物不一致的序列；所得到的高質(zhì)量序列統(tǒng)一保留250 bp，用UPARSE進(jìn)行聚類，相似度大于97%的序列定義為一個(gè)分類操作單元(OTU)；嵌合體用UCHIME去除；采用Excel 2010與SPSS 20軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素ANOVO進(jìn)行方差分析不同時(shí)間點(diǎn)微生物相對(duì)豐度的差異(P<0.05)。

1.4.2 分析方法

溫度敏感真菌的分析：尋找受溫度影響較大的真菌個(gè)體，以O(shè)TU為單位的相對(duì)豐度變化為依據(jù)，引入“溫度響應(yīng)”的概念[9]。溫度響應(yīng)=25℃真菌相對(duì)豐度-15℃真菌相對(duì)豐度。在兩個(gè)溫度下真菌相對(duì)豐度都為0的OTU不參與統(tǒng)計(jì)。在相對(duì)豐度有顯著性差異(P<0.05)的前提下，溫度響應(yīng)值為正值的稱為熱響應(yīng)真菌，負(fù)值的稱為冷響應(yīng)真菌，統(tǒng)稱為溫度敏感真菌。選出這些熱響應(yīng)或冷響應(yīng)的OTU后再按照“目”分類水平歸類。另一方面，把所有真菌按照“目”分類水平歸類后比較哪些菌目受到溫度變化影響較大，菌目名后綴為_In_se表示分類未確定，表征公式為：相對(duì)豐度變化=log10[(25℃相對(duì)豐度-15℃相對(duì)豐度)/15℃相對(duì)豐度×100]。只取相對(duì)豐度大于0.05%的菌目參與比較。正值表示相對(duì)豐度隨溫度上升而增加，負(fù)值表示相對(duì)豐度隨溫度上升而減少。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤性質(zhì)對(duì)真菌群落總豐度溫度敏感性的影響

從圖1結(jié)果可看出，真菌群落總豐度的變化范圍為3.35×107～1.99×108個(gè)·g-1土。在自然土壤中，自然土壤的真菌升溫后總豐度降低了13.48%；在改變?yōu)檗r(nóng)田土壤后，自然土壤的真菌升溫后總豐度降低了3.57%。在農(nóng)田土壤中，農(nóng)田土壤的真菌升溫后總豐度增加了15.66%；在改變?yōu)樽匀煌寥篮螅r(nóng)田土壤的真菌升溫后總豐度降低了22.66%。但以上真菌豐度隨溫度變化的差異都不顯著?？傮w來說，不論是在自然土壤中，還是農(nóng)田土壤中，真菌群落總豐度都沒有隨溫度升高發(fā)生顯著性變化。

圖1 土壤性質(zhì)對(duì)真菌群落總豐度溫度敏感性的影響

2.2 土壤性質(zhì)對(duì)溫度敏感真菌目個(gè)數(shù)的影響

從圖2結(jié)果可看出，在土壤性質(zhì)由自然土壤改變?yōu)檗r(nóng)田土壤后，來自自然土壤的真菌中溫度敏感真菌目個(gè)數(shù)由11減少為10，其中冷響應(yīng)真菌目的數(shù)目不變，熱響應(yīng)真菌目的個(gè)數(shù)由2減少為1。另外，在土壤性質(zhì)由農(nóng)田土壤改變?yōu)樽匀煌寥篮?，來自農(nóng)田土壤的真菌中溫度敏感真菌目個(gè)數(shù)由7增加到11，其中熱響應(yīng)真菌目的數(shù)目不變，冷響應(yīng)真菌目的個(gè)數(shù)由5增加到9。

圖2 土壤性質(zhì)對(duì)溫度敏感真菌目個(gè)數(shù)的影響

2.3 土壤性質(zhì)對(duì)溫度敏感真菌累積相對(duì)豐度的影響

從圖3結(jié)果可看出，在培養(yǎng)溫度從15℃升高到25℃后，自然土壤的真菌在自然土壤中冷響應(yīng)和熱響應(yīng)真菌累積相對(duì)豐度之和從2.22%減少為1.35%，其中熱響應(yīng)真菌累積相對(duì)豐度從0.09%增加到0.48%，冷響應(yīng)真菌累積相對(duì)豐度從2.12%減少為0.88%。土壤性質(zhì)改為農(nóng)田土壤后，自然土壤的真菌中冷響應(yīng)和熱響應(yīng)真菌累積相對(duì)豐度之和從1.25%減少為0.56%，其中熱響應(yīng)真菌累積相對(duì)豐度從0.001%增加到0.03%，冷響應(yīng)真菌累積相對(duì)豐度從1.25%減少為0.53%。在培養(yǎng)溫度從15℃升高到25℃后，農(nóng)田土壤的真菌在農(nóng)田土壤中冷響應(yīng)和熱響應(yīng)真菌累積相對(duì)豐度之和從13.66%增加到19.03%，其中熱響應(yīng)真菌累積相對(duì)豐度從13.54%增加到18.99%，冷響應(yīng)真菌累積相對(duì)豐度從0.12%減少為0.04%。土壤性質(zhì)改為自然土壤后，農(nóng)田土壤的真菌中冷響應(yīng)和熱響應(yīng)真菌累積相對(duì)豐度之和從6.01%減少為2.51%，其中熱響應(yīng)真菌累積相對(duì)豐度從0.01%增加到0.11%，冷響應(yīng)真菌累積相對(duì)豐度從6.00%減少為2.40%。

圖3 土壤性質(zhì)對(duì)溫度敏感真菌累積相對(duì)豐度的影響

2.4 土壤性質(zhì)對(duì)冷、熱響應(yīng)真菌群落組成的影響

圖4表示的是冷、熱響應(yīng)真菌群落內(nèi)部相對(duì)豐度組成。15℃下，在自然土壤環(huán)境下，來自自然土壤的真菌中熱響應(yīng)真菌有Capnodiales、Chaetothyriales，內(nèi)部群落豐度組成分別為1.06%、98.94%；土壤環(huán)境改為農(nóng)田土壤后，熱響應(yīng)真菌有Eurotiales，內(nèi)部群落豐度組成為100%。另外，來自農(nóng)田土壤的真菌在農(nóng)田土壤環(huán)境下熱響應(yīng)真菌有Capnodiales、Sordariales，內(nèi)部群落豐度組成分別為99.96%、0.04%；土壤環(huán)境改為自然土壤后，熱響應(yīng)真菌有Chaetothyriales、Hypocreales，內(nèi)部群落豐度組成分別為91.67%、8.33%。25℃下，改變土壤性質(zhì)對(duì)熱響應(yīng)真菌相對(duì)豐度的影響類似于15℃。

圖4 土壤性質(zhì)對(duì)熱、冷響應(yīng)真菌群落組成的影響

從圖4結(jié)果可看出，15℃下，在自然土壤環(huán)境下，來自自然土壤的真菌中冷響應(yīng)真菌有Agaricales、Chaetosphaeriales、Eurotiales、Hypocreales、Mortierellales、Pezizales、Pleosporales、Sordariales、Tremellales，內(nèi)部群落豐度組成分別為0.44%、37.79%、4.09%、6.26%、3.95%、1.68%、6.07%、34.73%、4.98%；土壤環(huán)境改為農(nóng)田土壤后，冷響應(yīng)真菌有Agaricales、Capnodiales、Chaetothyriales、Corticiales、Eurotiales、Hypocreales、Pleosporales、Sordariales、Spizellomycetales，內(nèi)部群落豐度組成分別為6.96%、54.58%、3.61%、0.50%、0.59%、30.02%、0.34%、1.43%、2.01%。另外，來自農(nóng)田土壤的真菌在農(nóng)田土壤環(huán)境下冷響應(yīng)真菌有Chaetothyriales、Eurotiales、Helotiales、Microascales、Pezizales，內(nèi)部群落豐度組成分別為58.97%、12.82%、8.55%、8.55%、11.11% ；土壤環(huán)境改為自然土壤后，冷響應(yīng)真菌有Botryosphaeriales、Capnodiales、Chaetosphaeriales、Eurotiales、Pezizales、Pleosporales、Sordariales、Trechisporales、Verrucariales，內(nèi)部群落豐度組成分別為2.24%、60.60%、5.83%、0.44%、3.20%、8.82%、9.29%、6.76%、2.83%。25℃下，改變土壤性質(zhì)對(duì)冷響應(yīng)真菌相對(duì)豐度的影響類似于15℃。

2.5 土壤性質(zhì)對(duì)土壤真菌的溫度響應(yīng)程度的影響

如圖5所示，把土壤中所有真菌在目水平下分類后再比較相對(duì)豐度變化，以log10(相對(duì)豐度變化率%)來表征。在自然土壤環(huán)境下，來自自然土壤的真菌中因升溫相對(duì)豐度有顯著性減少的菌目有Eurotiales、Hypocreales、Sordariales，分別減少1.02、1.66、1.33；土壤環(huán)境改為農(nóng)田土壤后，因升溫相對(duì)豐度有顯著性減少的菌目有Capnodiales、Pezizomycotina_In_se，分別減少1.50、1.78。來自農(nóng)田土壤的真菌在農(nóng)田土壤環(huán)境下因升溫相對(duì)豐度有顯著性減少的菌目有Chaetosphaeriales、Pezizales、Pyrenulales，分別減少1.49、1.45、1.80；相對(duì)豐度有顯著性增加的菌目有Capnodiales，增加1.51；土壤環(huán)境改為自然土壤后，因升溫相對(duì)豐度有顯著性減少的菌目有Capnodiales、Chaetosphaeriales、Pezizomycotina_In_se，分別減少1.55、1.90、1.41；相對(duì)豐度有顯著性增加的菌目有Pleosporales，增加1.24。

圖5 土壤性質(zhì)對(duì)土壤真菌的溫度響應(yīng)程度的影響[目水平下，log10(相對(duì)豐度變化率%)]

3 結(jié)論與討論

本文探討了改變土壤性質(zhì)對(duì)土壤真菌溫度敏感性的影響。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，雖然農(nóng)田土壤真菌總豐度受土壤性質(zhì)的影響大于自然土壤真菌，但改變土壤性質(zhì)對(duì)自然和農(nóng)田土壤真菌總豐度溫度敏感性均沒有產(chǎn)生顯著性的影響，因此，本研究進(jìn)一步要從群落結(jié)構(gòu)的角度進(jìn)行深入的分析。

有研究表明，在對(duì)具有溫度敏感真菌分類時(shí)，在目水平上的分類最為靈敏，因此本試驗(yàn)也采用目水平上的分類[10]。本研究鑒定了對(duì)于溫度具有敏感性的真菌，并依據(jù)其相對(duì)豐度變化與溫度變化的正負(fù)關(guān)系將其分為熱響應(yīng)真菌和冷響應(yīng)真菌。結(jié)果表明，無論是自然土壤或農(nóng)田土壤的真菌，一旦改變其所在的土壤性質(zhì)就會(huì)改變溫度敏感真菌的個(gè)數(shù)。改變土壤性質(zhì)主要減少自然土壤真菌中的熱響應(yīng)真菌的個(gè)數(shù)，增加農(nóng)田土壤真菌中的冷響應(yīng)真菌的個(gè)數(shù)。有研究表明，升溫會(huì)增加土壤真菌的多樣性，但是施肥處理則會(huì)降低真菌的多樣性，這就可能導(dǎo)致自然土壤真菌在改變土壤性質(zhì)為農(nóng)田土壤后溫度敏感真菌個(gè)數(shù)的減少，而農(nóng)田土壤真菌在改變土壤性質(zhì)為自然土壤后溫度敏感真菌個(gè)數(shù)增加[11]。改變土壤性質(zhì)分別減少了自然土壤真菌中熱響應(yīng)和冷響應(yīng)真菌的累積相對(duì)豐度，增加了農(nóng)田土壤中冷響應(yīng)真菌的累積相對(duì)豐度，而熱響應(yīng)真菌的累積相對(duì)豐度降低。

以往研究表明，溫度的升高會(huì)導(dǎo)致真菌整體群落組成的改變[12-14]。本研究進(jìn)一步證實(shí)，改變土壤性質(zhì)使這些溫度敏感真菌的群落組成發(fā)生了改變。土壤性質(zhì)改變后，自然土壤真菌的熱響應(yīng)真菌由Capnodiales、Chaetothyriales變?yōu)镋urotiales；冷響應(yīng)真菌由Agaricales、Chaetosphaeriales、Eurotiales、Hypocreales、Mortierellales、Pezizales、Pleosporales、Sordariales、Tremellales變?yōu)锳garicales、Capnodiales、Chaetothyriales、Corticiales、Eurotiales、Hypocreales、Pleosporales、Sordariales、Spizellomycetales。改變土壤性質(zhì)后，農(nóng)田土壤真菌的熱響應(yīng)真菌由Capnodiales、Sordariales變?yōu)镃haetothyriales、Hypocreales；冷響應(yīng)真菌由Chaetothyriales、Eurotiales、Helotiales、Microascales、Pezizales變?yōu)锽otryosphaeriales、Capnodiales、Chaetosphaeriales、Eurotiales、Pezizales、Pleosporales、Sordariales、Trechisporales、Verrucariales。然而，與其他研究者的結(jié)果對(duì)比來看，本試驗(yàn)中溫度敏感真菌占真菌總體的比例還是小了許多[15]，原因可能是其他研究者的培養(yǎng)時(shí)間長于本試驗(yàn)的培養(yǎng)時(shí)間。如果延長培養(yǎng)時(shí)間，土壤真菌種群還會(huì)改變，因?yàn)檎婢郝鋵?duì)升溫具有一定的抗性，因此需要更長的時(shí)間才能體現(xiàn)出溫度所帶來的影響，從而更好地研究土壤性質(zhì)改變對(duì)真菌溫度敏感性的影響[16]。

不同微生物往往因?yàn)檫z傳背景不同，在生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮的功能也具有較大差異[17]。有研究表明，在本研究中發(fā)現(xiàn)的受土壤性質(zhì)影響的溫度敏感真菌的功能可能存在差異。如Capnodiales是一種拮抗菌，可以增強(qiáng)植物的抗病性[18]；Chaetothyriales與磷代謝相關(guān)[19]；Eurotiales、Chaetosphaeriales、Corticiales都是降解纖維素的真菌[20-22]；Mortierellales是一種腐生菌，善于降解有機(jī)質(zhì)[23]；Pezizales是菌根共生菌，會(huì)促進(jìn)植物生長[24]；Spizellomycetales在土壤氮循環(huán)方面發(fā)揮作用[25]。因此，根據(jù)改變土壤性質(zhì)造成的自然土壤溫度敏感真菌群落的變化，推測(cè)熱響應(yīng)真菌功能由植物保護(hù)、磷代謝功能變?yōu)槔w維素降解功能；冷響應(yīng)真菌功能由有機(jī)質(zhì)降解、促進(jìn)植物生長功能變?yōu)橹参锉Ｗo(hù)、磷代謝、氮代謝功能。此外，Sordariales具有反硝化功能[26]；Hypocreales與磷循環(huán)相關(guān)[27]；Helotiales與氮循環(huán)相關(guān)[28]；Botryosphaeriales是一種內(nèi)生菌，也是植物的病原菌[29]。因此，根據(jù)改變土壤性質(zhì)造成的農(nóng)田土壤溫度敏感真菌群落的變化，推測(cè)熱響應(yīng)真菌功能由植物保護(hù)、反硝化功能變?yōu)榱状x功能；冷響應(yīng)真菌功能由磷代謝、氮代謝功能變?yōu)橹参锊『Α⒗w維素降解、反硝化功能。

本實(shí)驗(yàn)探索了改變紅壤性質(zhì)對(duì)真菌溫度敏感性的影響，發(fā)現(xiàn)：(1)改變土壤性質(zhì)會(huì)改變溫度敏感真菌目分類水平上的數(shù)量；(2)改變土壤性質(zhì)會(huì)改變溫度敏感真菌的種類和相對(duì)豐度。雖然本研究沒有研究真菌所對(duì)應(yīng)的功能，但根據(jù)以往關(guān)于微生物功能具有遺傳特異性的研究結(jié)果[17]，可以推測(cè)，改變土壤性質(zhì)可能對(duì)真菌功能的溫度敏感性產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。

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