孫 放

(蘇州大學(xué)紡織與服裝工程學(xué)院, 江蘇 蘇州 215021)

通過(guò)一定濃度的溴化鋰溶液溫度處理脫膠過(guò)的蠶絲，可獲得絲素蛋白溶液。天然絲素蛋白因其良好的生物相容性、可降解性、無(wú)毒無(wú)害、表面有多種官能團(tuán)(易于各種官能團(tuán)交聯(lián))、良好的可成型性(可以制成支架、膜、多孔海綿、水凝膠、纖維、顆粒等不同形態(tài))，在生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。三維生物打印是制備支架的一種新方法，利用計(jì)算機(jī)輔助軟件來(lái)設(shè)計(jì)和制造各種形狀的三維支架，可以精確控制支架的孔徑大小和分布，成型時(shí)間短，適合自動(dòng)化大規(guī)模生產(chǎn)。絲蛋白三維打印存在的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題是如何改善蠶絲蛋白的快速凝膠成型的問(wèn)題。

1 絲素蛋白的結(jié)構(gòu)性能及應(yīng)用

1.1 絲素蛋白的結(jié)構(gòu)與理化性能

蠶絲(如圖1所示)的主要成分是絲素和絲膠，絲素蛋白是蠶絲最主要的組成部分，占總質(zhì)量的70%左右，是一種天然高分子纖維蛋白，含有18種氨基酸以甘氨酸(Glycine)、絲氨酸(Serine)和丙氨酸(Alanine)為主，絲素蛋白包括一條相對(duì)分子質(zhì)量很大的肽鏈(H鏈)、一條相對(duì)分子質(zhì)量小的肽鏈(L鏈)以及p25糖蛋白，絲素存在兩種不同的晶體結(jié)構(gòu)方式，絲素Ι(Silk Ι)和絲素Ⅱ(Silk Ⅱ)，絲素Ι是不穩(wěn)定的而絲素Ⅱ是穩(wěn)定的，絲素Ι經(jīng)過(guò)極性溶劑、稀酸、濕熱等的處理會(huì)變成穩(wěn)定的絲素Ⅱ結(jié)構(gòu)[1]。絲素蛋白的結(jié)晶部分以β-折疊為主，不能溶于水只能變得膨脹，也不溶于有機(jī)溶劑，如乙醇等，但是可以在某些中性鹽溶液中無(wú)限擴(kuò)張而得到粘稠的液體，經(jīng)過(guò)透析除去鹽可得到絲素的純?nèi)芤篬2]。絲素蛋白具有良好的物理機(jī)械性能，如透氣、透濕，緩慢釋放，抗拉強(qiáng)度好、柔韌性好等優(yōu)點(diǎn)。

圖1 蠶絲蛋白的主要成分及結(jié)構(gòu)示意圖

1.2 絲素蛋白的生物性能

絲素蛋白是天然的高分子蛋白，具有很好的生物學(xué)性能：(1)安全性：絲素是天然的高純度蛋白質(zhì)，氨基酸排列順序是已知的，用于手術(shù)縫合線已有很長(zhǎng)的歷史；(2)可設(shè)計(jì)性：絲素具有四種高級(jí)結(jié)構(gòu)(無(wú)規(guī)卷曲、絲素Ι、Ⅱ、Ⅲ型)，它們之間能夠相互轉(zhuǎn)化，絲素經(jīng)過(guò)不同的處理可以得到各種形態(tài)，如纖維、溶液、粉、膜、水凝膠以及三維支架等，也可以與其他材料復(fù)合來(lái)改善絲素的結(jié)構(gòu)與性能；(3)生物相容性：多種細(xì)胞可以在絲素蛋白上很好地黏附、生長(zhǎng)、增殖和分化；(4)特殊的性能：絲素蛋白有良好的機(jī)械性能，可以在體內(nèi)降解并且速度緩慢可調(diào)，還擁有良好的促進(jìn)血管化的能力，優(yōu)良的透水透氧性能[3]。

1.3 絲素蛋白的應(yīng)用

由于絲素蛋白良好的性能，現(xiàn)已將絲素蛋白用于食品、化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域，絲素蛋白可用作人工皮膚、細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)、生物傳感器、藥物控釋材料、生物酶防護(hù)劑、隱形眼鏡、抗凝血材料、酶固定劑等[4]。Meinel等[5]在骨組織修復(fù)中使用絲蛋白三維多孔支架，他們的研究表明這種支架穩(wěn)定可靠，可用于骨組織再生修復(fù)。Ma Liang等[6]用全物理過(guò)程制備三維的多孔絲素蛋白支架，將鼠hMSCs與上述素支架在體外復(fù)合培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明hMSCs能在絲素上良好地粘附、增殖和生長(zhǎng)，材料未影響細(xì)胞的生長(zhǎng)周期，沒(méi)有檢測(cè)到異倍體細(xì)胞，支架材料與hMSCs的生物相容性好。Lin Jing等[7]研究絲素支架的細(xì)胞相容性，在絲素多孔支架上培養(yǎng)成纖維細(xì)胞、人成骨肉瘤細(xì)胞及肝細(xì)胞，結(jié)構(gòu)表明這些各種動(dòng)物細(xì)胞能夠很好地黏附生長(zhǎng)和繁殖在所制備的絲素多孔支架上。

2 明膠的結(jié)構(gòu)性能及應(yīng)用

2.1 明膠的結(jié)構(gòu)與性能

A.G.Ward認(rèn)為，膠原經(jīng)溫和而不可逆的斷裂后的主要產(chǎn)物為明膠[8]。膠原是大型哺乳動(dòng)物的骨、皮、肌腱和韌膜等組織細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，對(duì)機(jī)體和器官起著保護(hù)和支撐的作用，膠原具有三股螺旋結(jié)構(gòu)，明膠是膠原的三股螺旋結(jié)購(gòu)破壞后形成的不規(guī)則盤區(qū)的螺旋卷曲狀線性肽鏈分子[9]。明膠分子結(jié)構(gòu)上有大量的極性基團(tuán)(-OH、-COOH、-NH2)，這使得明膠具有極強(qiáng)的親水性。明膠易溶于溫水，冷卻形成凝膠，不溶于冷水，在冷水中吸水膨脹，不溶于有機(jī)溶劑，明膠含有甘氨酸、脯氨酸、羥基脯氨酸及丙氨酸等人體所需的氨基酸，其中甘氨酸占總量的三分之一，脯氨酸和羥基脯氨酸占總量三分之一[10]。

明膠是天然的高分子蛋白，在結(jié)構(gòu)上，明膠與生物組織很相似，明膠除了有很好的生物相容性之外，還有生物可降解性，得到的降解物不容易有炎癥反應(yīng)且易被吸收，此外還具有低免疫原性、抗氧化性和抗菌性[11]。

2.2 明膠的應(yīng)用

明膠在食品、照相、化妝品等工業(yè)領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用。食用明膠可以用于食品添加，提升食品的口感和外觀，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高；照相明膠主要用于制造感光材料，如拍照時(shí)使用的膠卷和膠片等；化妝品中的明膠、膠原及其水解產(chǎn)物對(duì)頭發(fā)和皮膚等具有修復(fù)、去污、保濕的功效。明膠由于其優(yōu)良的生物性能，在生物醫(yī)藥材料中的應(yīng)用也很廣泛，明膠可制作藥物膠囊、止血敷料、血液代用品、組織工程支架等[10-11]。

3 絲素蛋白的三維打印

3.1 三維打印及應(yīng)用

三維打印(Three Dimensional Printing，簡(jiǎn)稱3DP)，也稱添加制造(Additive Manufacturing，AM)，是一種新興的快速成型技術(shù)。它是在計(jì)算機(jī)的控制下，以物體的計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)(CAD) 模型或者計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT) 等數(shù)字模型文件為基礎(chǔ)，通過(guò)分層加工、逐層疊加材料(包括液體、粉材、線材或塊材等)的方式來(lái)構(gòu)造任意形狀的3D物體的技術(shù)。

圖2 三維生物打印示意圖

三維打印于20世紀(jì)90年代由美國(guó)麻省理工學(xué)院(MIT)首次發(fā)明，被認(rèn)為是制造領(lǐng)域的一次重大突破，也被眾多行內(nèi)人士和國(guó)內(nèi)外媒體譽(yù)為“第三次工業(yè)革命重要生產(chǎn)工具”。三維打印常用在模具制造、工業(yè)設(shè)計(jì)等領(lǐng)域，現(xiàn)在不僅用于傳統(tǒng)制造領(lǐng)域，而且還被成功地運(yùn)用到了醫(yī)學(xué)與生物醫(yī)學(xué)工程中[12-16]。目前，三維打印設(shè)備和可供三維打印的材料不能滿足三維打印的需求，尤其是可供三維打印的材料。三維打印技術(shù)所用的材料主要是經(jīng)過(guò)特殊處理的粘合劑和高分子材料，并且要求材料有很好的固化反應(yīng)速度。作為可用于三維打印的材料，要求可以快速并且精確地成型，不同的三維打印技術(shù)有著各自對(duì)于材料的要求，可以說(shuō)可供三維打印的材料的研發(fā)，極大地影響了三維打印技術(shù)的發(fā)展[12]?，F(xiàn)階段，應(yīng)用廣泛的三維打印技術(shù)主要有：熔融沉積成型(Fused Deposition Modeling) 、光固化立體印刷(Stereo Lithography Apparatus )和粉末材料選擇性激光燒結(jié)(Selective Laser Sintering) 等[17]。

近年來(lái)，三維打印在機(jī)械設(shè)備、生活用品、生物醫(yī)用材料，甚至是活體器官等領(lǐng)域得到迅速發(fā)展。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，三維打印技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于制造個(gè)性化組織工程支架、器官模型和假體植入物，還用于策劃和分析手術(shù)方案，甚至可以直接打印出組織和細(xì)胞等[16]。

3.2 三維生物打印的研究現(xiàn)狀

組織工程用于制備絲素多孔支架的傳統(tǒng)方法有：相分離/冷凍干燥法、制孔劑法、靜電紡絲法、氣體發(fā)泡法等[17]。然而，這些技術(shù)的缺點(diǎn)包括高毒性的有機(jī)溶劑的大量使用，制備期間太長(zhǎng)，過(guò)程勞動(dòng)過(guò)于密集，在聚合物基體中的殘余顆粒的不能完全去除，重復(fù)性差，孔的形狀不規(guī)則，孔隙以及薄壁結(jié)構(gòu)的互通不充足，此外，大多數(shù)這些方法對(duì)形狀控制有限制[18]。三維打印法(快速成型)是制備三維支架的一種新方法，是利用計(jì)算機(jī)輔助軟件來(lái)設(shè)計(jì)和制造各種形狀的三維支架，可以精確控制支架的孔徑大小和分布，成型時(shí)間短，適合自動(dòng)化大規(guī)模生產(chǎn)，使用方便、易消毒，對(duì)溶液表面影響小，具有其它方法沒(méi)有的優(yōu)點(diǎn)[19]。

Skander Limem等[20]將0.6%的絲素水溶液噴墨打印在聚乙烯塑料基底上，然后在打印出來(lái)的絲素線上種植人體骨髓干細(xì)胞，在100ng/mL的BMP-2存在的條件下培養(yǎng)，一周后細(xì)胞開始生長(zhǎng)并粘附在絲素線上。Sourabh Ghosh等[21]將絲蛋白通過(guò)一個(gè)安裝在三軸計(jì)算機(jī)控制平臺(tái)上的微細(xì)噴嘴沉積到富含甲醇的儲(chǔ)液器中，以使得沉積的纖維通過(guò)誘導(dǎo)結(jié)晶進(jìn)行快速凝固，通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明直寫組裝的三維絲素蛋白支架支持人類骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSC)的粘附和增長(zhǎng)，在這些支持支架上軟骨細(xì)胞條件下培養(yǎng)的細(xì)胞與標(biāo)準(zhǔn)微球培養(yǎng)相比，由于增加的糖胺聚糖的產(chǎn)量，所以提高了軟骨細(xì)胞的分化，三維絲素蛋白支架由于其支架結(jié)構(gòu)的精確控制及其生物相容性，可能會(huì)在組織工程構(gòu)建上有潛在的應(yīng)用。Lin Sun，Sara T.Parker等[22]將絲素與羥基磷灰石混合，利用直寫組裝打印出三維支架，這種方法可以對(duì)于打印出的支架中的長(zhǎng)纖維的大小和位置做出精確控制，然后將hMSCs和hMMECs混合培養(yǎng)在這些三維支架上，hMSCs和hMMECs在絲素和羥基磷灰石的三維支架上的細(xì)胞外基質(zhì)形成了錯(cuò)綜復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。

盡管絲素蛋白擁有許多優(yōu)異的性能，不過(guò)和很多人工合成高聚物相比，未經(jīng)處理的絲素蛋白支架因其結(jié)晶度低，導(dǎo)致強(qiáng)度低、易破碎等缺陷，而且絲素蛋白溶液品質(zhì)受到原料質(zhì)量影響。為了改善絲素蛋白的結(jié)構(gòu)和特性以得到理想的組織工程支架材料，可以通過(guò)對(duì)絲素的理化性能進(jìn)行改進(jìn)或者與其他多聚物復(fù)合來(lái)得到，絲素蛋白主要與殼聚糖、硅酸鈣、羥基磷灰石、明膠、膠原蛋白、聚己內(nèi)酯、聚乳酸-羥基乙酸共聚物等材料復(fù)合來(lái)制備組織工程支架[2,17]。Li Mingzhong等通過(guò)絲蛋白和明膠共混，制備一種斷裂伸長(zhǎng)和彈性模量等性能均比純絲素蛋白溶液制成的膜性能都好的膜[23-24]。Yin Lihua等[25]用冷凍干燥技術(shù)制備絲素明膠三維支架，發(fā)現(xiàn)明膠的加入有利于穩(wěn)定支架的結(jié)構(gòu)以及提高支架的熱穩(wěn)定性。

4 前景和展望

利用三維打印制備生物支架與運(yùn)用傳統(tǒng)方法制備生物支架相比，存在可以控制支架的形狀和結(jié)構(gòu)，從而使其滿足不同領(lǐng)域的應(yīng)用要求的優(yōu)勢(shì)；絲素和明膠都有很好的生物相容性，且明膠的加入可以改善絲蛋白的凝膠成型性，是很好的生物支架材料。三維打印制備絲素蛋白基支架結(jié)合了三維打印和明膠與絲蛋白混合兩者的優(yōu)點(diǎn)，產(chǎn)品存在潛在的應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)：

[1] 張幼珠. 紡織應(yīng)用化學(xué)[M]. 東華大學(xué)出版社. 2009: 93-96.

[2] 段巧艷, 段祥, 張煥相. 絲素蛋白在組織工程中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù), 2007, 11(26): 5199-5203.

[3] 盧神州. 絲素蛋白材料的生物學(xué)性能[J]. 絲綢, 2008 (12): 58-62.

[4] 張海萍, 朱良均, 閔思佳. 絲素蛋白的結(jié)構(gòu)、制備及其應(yīng)用研究進(jìn)展[C].全國(guó)桑樹種質(zhì)資源及育種和蠶桑綜合利用學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集.中國(guó)蠶學(xué)會(huì),2006:233-239.

[5] Meinel L, Fajardo R, Hofmann S, et al. Silk implants for the healing of critical size bone defects[J]. Bone, 2005, 37(5): 688-698.

[6] 馬亮, 王洪, 李艷軍, 等. 三維絲素支架材料制備及其與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物相容性[J]. 中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù), 2007, 11(40): 8021-8024.

[7] 林靜, 馬西蘭, 曹傳寶. 天然絲素制備三維多孔支架[J]. 北京理工大學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 31(9): 1109-1113.

[8] A.G.Ward, A. Courts. 明膠的科學(xué)與工藝學(xué)[M]. 北京:輕工業(yè)出版社, 1982:26-28.

[9] 朱欣星, 安然, 李昌朋, 等. 膠原與明膠的結(jié)構(gòu)研究: 方法, 結(jié)果與分析[J]. 皮革科學(xué)與工程, 2012, 22(5): 9-14.

[10] 繆進(jìn)康. 明膠及其在科技領(lǐng)域中的利用[J]. 明膠科學(xué)與技術(shù), 2009, 29(1): 28-49.

[11] 厲從雷. 明膠在生物醫(yī)用材料中的應(yīng)用[J]. 明膠科學(xué)與術(shù),2013,(2):85-89.

[12] 孫聚杰. 3D 打印材料及研究熱點(diǎn)[J]. 絲網(wǎng)印刷, 2013, (12): 34-39.

[13] 劉欣靈. 3D 打印機(jī)及其工作原理[J]. 網(wǎng)絡(luò)與信息, 2012, 26(2): 30-30.

[14] 吳平. 3D打印技術(shù)及其未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)[J]. 印刷質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)化,2014,(1):8-10.

[15] 張冠石,翟為. 三維打印技術(shù)及其在醫(yī)療領(lǐng)域的應(yīng)用[J]. 中國(guó)醫(yī)療設(shè)備,2014,(1):66-69.

[16] 賀超良, 湯朝暉, 田華雨, 等. 3D 打印技術(shù)制備生物醫(yī)用高分子材料的研究進(jìn)展[J]. 高分子學(xué)報(bào), 2013 (6): 722-732.

[17] 殷麗華, 牟星, 余占海, 等. 絲素蛋白及其復(fù)合支架制備方法的研究進(jìn)展[J]. 材料導(dǎo)報(bào), 2013, 27(17): 110-112.

[18] Lam C X F, Mo X M, Teoh S H, et al. Scaffold development using 3D printing with a starch-based polymer[J]. Materials Science and Engineering: C, 2002, 20(01): 49-56.

[19] 廖銀琳, 王卉, 張克勤. 醫(yī)用組織工程多孔絲素支架制備方法的進(jìn)展[J]. 印染, 2012, 38(10): 48-53.

[20] Limem Skander, Claver Paul, Kim Hyeon Joo, et al. Differentiation of bone marrow stem cells on inkjet printed silk lines[J]. Materials Research Society, 2007,(950):99-102.

[21] Ghosh S, Parker S T, Wang X, et al. Direct-Write Assembly of Microperiodic Silk Fibroin Scaffolds for Tissue Engineering Applications[J]. Advanced Functional Materials, 2008, 18(13): 1883-1889.

[22] Sun L, Parker S T, Syoji D, et al. Direct-Write Assembly of 3D Silk/Hydroxyapatite Scaffolds for Bone Co‐Cultures[J]. Advanced healthcare materials, 2012, 1(6): 729-735.

[23] 李明忠, 盧神州. 明膠/絲素共混多孔膜的制備[J]. 東華大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2002, 28(3): 74-78.

[24] 李明忠, 盧神州, 張練. 絲素/明膠共混膜的結(jié)構(gòu)和性能[J]. 紡織學(xué)報(bào), 2001, 22(6): 404-406.

[25] 殷麗華,彭鵬,牟星,程文曉,黃嵩濤,余占海. 絲素/明膠三維多孔支架的構(gòu)建及其結(jié)構(gòu)和性能表征[J]. 功能材料,2013,23:3388-3391.