蔡遜 王世杰 馬丹丹 張智勇

結(jié)腸癌是消化道常見的惡性腫瘤之一，目前其在我國的發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1-2]。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是導致結(jié)腸癌死亡的主要原因[3-5]，其中肝臟轉(zhuǎn)移是最常見的遠處轉(zhuǎn)移[6]。因此，如能阻斷結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移途徑，則能大大提高結(jié)腸癌病人的生存率。近年來，趨化因子及其受體在腫瘤發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移中的作用受到廣泛關(guān)注[7-8]。研究表明：趨化因子受體7(chemokine receptor 7，CCR7)是7次跨膜受體G蛋白偶聯(lián)受體，在腫瘤細胞的增殖、遷移、播散及腫瘤血管形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用[9-10]。本研究旨在采用免疫組織化學、Real-time PCR及Western blot等技術(shù)檢測CCR7在90例結(jié)腸癌組織中的表達情況，探討其表達水平與與結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移等臨床病理特征的相關(guān)性。以期為尋找結(jié)腸癌新的治療靶點提供有力依據(jù)。

資料與方法

一、資料及試劑

1.一般資料 選取我院2015年1月至12月的90例人結(jié)腸癌組織及其配對癌旁組織標本，所有標本均經(jīng)病理證實，且術(shù)前未行化療或放療。癌旁組織標本取自至少距腫瘤邊緣5cm處，新鮮標本離體后立即置入液氮中保存。所有標本的獲取均征得病人本人及家屬同意，并通過本院倫理委員會批準。

2.主要試劑 兔抗人CCR7單克隆抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體及辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠二抗均購自Abcam公司。Trizol試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Invitrogen公司，總蛋白抽提試劑盒、RNA提取試劑盒購自Tiangen公司。免疫組織化學試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液購自武漢博士德生物公司。CCR7引物序列為：上游引物是5′-AGGCTATTGTCCCCTAAACC-3′及下游引物是5′-GGAGGACAGTGAAGAAAACG-3′；β-actin引物序列為：上游引物是5′-TGAGACCTTCAACACCCCAG-3′及下游引物是5′-GCCATCTCTTGCTCGAAGTC-3′。均由上海英駿生物工程技術(shù)服務公司設計并合成。

二、實驗方法

1.免疫組織化學染色及結(jié)果判定 免疫組織化學染色按試劑盒實驗步驟操作，常規(guī)石蠟切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，微波抗原修復，兔抗人CCR7單克隆抗體(1∶200稀釋)，4 ℃過夜孵育，DAB顯色，蘇木精復染，脫水，透明，中性樹膠封片固定。用磷酸鹽緩沖液(PBS)替代一抗作陰性對照，相同條件下每個樣本重復3次。結(jié)果判定標準：CCR7表達免疫組織化學結(jié)果根據(jù)陽性細胞率進行評定和分析。未見陽性細胞或陽性細胞率<5%判定為陰性(-)，陽性細胞率5%～25%定為弱陽性(+)，25%～50%為中度陽性(++)，>50%為強陽性(+++)。

2. Real-time PCR檢測CCR7 mRNA表達 采用Trizol試劑盒提取90例結(jié)腸癌組織及配對癌旁組織的總mRNA，以紫外分光光度儀檢測其吸光度值(A260 nm/A280 nm值為1.8～2.0為理想值)，計算其濃度以便指導逆轉(zhuǎn)錄模板的需要量。接著用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，保存于-80℃冰箱備用。所有操作步驟均按照說明書進行。Real-time PCR總反應體系為20 μl：2×SYBR Green mix緩沖液10 μl，10 μmol/L的上下游引物各0.6 μl，cDNA 2 μl，DEPC水6.8 μl。反應參數(shù)為：94℃預變性2 min；94 ℃變性20 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s；共35個循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。每個樣本均做3個復孔，并重復3次。各組中CCR7的相對表達量通過2-ΔΔCt法進行計算。

3.Western blot檢測CCR7蛋白表達 分別稱取0.1 g結(jié)腸癌組織和癌旁組織，加800 μl全蛋白提取液(放射免疫沉淀裂解液，RIPA)，含10%蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(PMSF)提取蛋白。采用Bradford法進行蛋白定量。各組150 μg上樣于5.0%濃縮膠，15%分離膠，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離。電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移蛋白于PVDF膜，加5%脫脂奶粉稀釋的一抗CCR7及β-actin(1∶500稀釋)封閉，4 ℃過夜，加HRP標記二抗(1∶5000稀釋)，37 ℃條件溫育2 h，化學發(fā)光法顯影檢測。免疫印跡條帶的灰度值經(jīng)灰度掃描儀分析后獲得。CCR7相對表達水平通過與內(nèi)參比較確定。

三、統(tǒng)計學方法

結(jié) 果

一、免疫組織化學染色結(jié)果

在90例結(jié)腸癌組織及癌旁組織中CCR7主要表達于細胞質(zhì)，呈棕黃色，詳見圖1。在癌旁組織中，細胞質(zhì)著色多為淡黃色，CCR7為陰性，弱陽性或中度陽性，然而，在結(jié)腸癌組織中，細胞質(zhì)染色較深，以棕黃色和棕黑色為主，CCR7弱陽性、中度陽性或強陽性。中度陽性及強陽性均判定為陽性表達。組織學評分后的統(tǒng)計結(jié)果顯示，CCR7蛋白在癌旁組織與結(jié)腸癌組織中的陽性表達率分別為36%(32/90)和77%(69/90)。經(jīng)χ2檢驗，兩者差異有統(tǒng)計學意義(χ2=25.689，P=0.000)。15例發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織中，CCR7著色深，有棕黃色顆粒，染色強度均為強陽性。45例發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織中62%(28/45)染色強度為強陽性，38%(17/45)染色強度為中度陽性。

A.無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組;B.淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組;C.遠處轉(zhuǎn)移組圖1 CCR7蛋白在結(jié)腸癌組織中的表達(免疫組織化學染色,×200)

二、CCR7在結(jié)腸癌中的基因表達

在90例結(jié)腸癌組織及其相應的癌旁組織中均可檢測到CCR7基因的表達，且CCR7 mRNA在結(jié)腸癌組織中的表達水平顯著高于癌旁組織(1.59±0.27比0.57±0.08，t=34.828，P=0.000)，見圖2。

*P<0.05圖2 CCR7基因在結(jié)腸癌組織及相應癌旁組織中的表達

三、CCR7在結(jié)腸癌中的蛋白表達

Western blot檢測結(jié)果顯示，CCR7蛋白在結(jié)腸癌組織及相應癌旁組織中均有表達，在結(jié)腸癌組織中的表達水平顯著高于癌旁組織(P<0.05)，且CCR7蛋白在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織中的表達水平顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，存在遠處轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌組織中的表達水平顯著高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。見圖3。

四、CCR7蛋白表達水平與結(jié)腸癌臨床病理特征之間的關(guān)系

CCR7蛋白在結(jié)腸癌組織中的表達量以結(jié)腸癌組織CCR7條帶的灰度值與對應的β-actin的灰度值之比來表示。通過統(tǒng)計分析顯示：CCR7蛋白表達量與結(jié)腸癌浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移及TNM分期顯著相關(guān)(P<0.05)，而與性別、年齡、腫瘤大小及分化程度無明顯相關(guān)(P>0.05)。詳見表1。

N:癌旁組織;T:結(jié)腸癌組織①無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移;②淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移;③遠處轉(zhuǎn)移圖3 CCR7蛋白在結(jié)腸癌組織及相應癌旁組織中的表達

表1 CCR7蛋白表達量與90例結(jié)腸癌臨床病理特征之間的關(guān)系±s)

討 論

趨化因子是指能使細胞發(fā)生趨化運動的分泌型小分子蛋白質(zhì)(相對分子質(zhì)量為8000～11000)，趨化因子受體是能夠特異性結(jié)合趨化因子的7次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體[11-12]。CCR7為CC類趨化因子受體之一，越來越多的證據(jù)[13-17 ]顯示，CCR7在黑色素瘤、乳腺癌、非小細胞肺癌和胃癌等腫瘤細胞中過度表達，與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。然而，對于CCR7在結(jié)腸癌生長、浸潤、侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用研究甚少。

在腫瘤組織及其相應鄰近正常組織的差異性表達是分析基因與腫瘤關(guān)系的基礎(chǔ)，異常表達的基因可能在腫瘤的形成中扮演重要角色，可認為是潛在的新一類控制細胞增殖和凋亡的癌基因和抑癌基因[18]。本研究中，筆者選取90例結(jié)腸癌病人的腫瘤組織及相應配對的癌旁組織，分別采用Real-timePCR和Westernblot技術(shù)檢測CCR7mRNA和蛋白表達，檢測結(jié)果表明CCR7在結(jié)腸癌組織中的表達顯著高于相應癌旁組織。免疫組織化學檢測結(jié)果顯示CCR7在結(jié)腸癌組織中的蛋白表達定位于細胞質(zhì)，在癌旁組織中，細胞質(zhì)著色多為淡黃色，CCR7為陰性，弱陽性或中度陽性，然而，在結(jié)腸癌組織中，細胞質(zhì)染色較深，以棕黃色和棕黑色為主，CCR7弱陽性、中度陽性或強陽性。進一步證實CCR7蛋白在結(jié)腸癌組織中的表達同樣顯著高于癌旁組織。有研究[13-17]稱CCR7在多種腫瘤中過表達，促進腫瘤細胞增殖、腫瘤血管生成及腫瘤細胞定向遷移。本研究結(jié)果證實：CCR7在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程中具有癌基因特性，促進結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展。與國外文獻報道基本一致。

本實驗采用Westernblot技術(shù)檢測CCR7在結(jié)腸癌組織中的蛋白表達量并分析其與臨床病理特征的關(guān)系，通過統(tǒng)計分析得出：CCR7蛋白表達量與結(jié)腸癌浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移及TNM分期顯著相關(guān)，然而與性別、年齡、腫瘤大小及分化程度無明顯相關(guān)性。Correale等[19]研究得出，CCR7在結(jié)腸癌中的表達與病人性別、年齡、腫瘤分型、分期無關(guān)，但在直腸癌中的表達與腫瘤分化、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究結(jié)果與其基本一致。本實驗采用免疫組織化學對90例結(jié)腸癌組織及配對的癌旁組織標本進行染色，實驗結(jié)果表明CCR7主要表達于結(jié)腸癌細胞的細胞膜或(和)細胞質(zhì)內(nèi)。組織學評分后的統(tǒng)計結(jié)果顯示，CCR7蛋白在癌旁組織與結(jié)腸癌組織中的陽性表達率分別為36%(32/90)和77%(69/90)，差異具有統(tǒng)計學意義。這與Malietzis等[20]的報道相符。本研究中，15例發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織中，CCR7著色深，有棕黃色顆粒，染色強度均為強陽性。45例發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織中62%(28/45)染色強度為強陽性，38%(17/45)染色強度為中度陽性。有研究[21]表明,約80%的結(jié)腸癌組織表達CCR7,且多因素回歸分析得出，CCR7高表達是與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)的最重要因素。本研究結(jié)果與這一結(jié)論相符。檢測結(jié)腸癌組織CCR7表達對預測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有較高的判斷價值。另外，術(shù)前對鏡檢標本或前哨淋巴結(jié)標本進行CCR7檢測，不僅可預測有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而且對手術(shù)方案的選擇及術(shù)后進一步的靶向治療均具有重要價值。

綜上所述，CCR7在結(jié)腸癌組織中存在過度表達，參與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程，促進其侵襲轉(zhuǎn)移，這可能是結(jié)腸癌發(fā)生局部浸潤和遠處轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵機制之一。阻斷CCR7的表達可能為結(jié)腸癌的治療提供新思路。

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