韓飛，王苗苗，毛瓊玲，張倩，李慕春*

(1.新疆維吾爾自治區(qū)分析測(cè)試研究院,新疆 烏魯木齊 830011;2.新疆天然產(chǎn)物綠色加工工程技術(shù)研究中心，新疆 烏魯木齊 830011)

準(zhǔn)噶爾柳(Salixsongarica)是楊柳科柳屬的植物,分布在中亞地區(qū)、伊朗、阿富汗以及中國(guó)大陸的新疆等地，生長(zhǎng)于海拔1 100～1 150 m的地區(qū)，多生在平原河谷以及荒漠小河邊，目前尚未由人工引種栽培[1]。準(zhǔn)噶爾柳是重要的藥用植物，同楊柳科其他植物一樣樹皮可提取水楊甙[2～4]。水楊甙被稱為“天然阿司匹林”，用于治療輕微發(fā)熱、感冒、感染、急性和慢性風(fēng)濕不適等病癥[5～6]。準(zhǔn)噶爾柳花為準(zhǔn)噶爾柳的干燥花序，具有清肺化痰、清熱解暑、止咳安神的功效，當(dāng)?shù)鼐S吾爾族居民常常將準(zhǔn)噶爾柳花作為一種茶。目前，對(duì)準(zhǔn)噶爾柳花的研究還未見報(bào)道。前期對(duì)柳花提取物進(jìn)行系統(tǒng)預(yù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)柳花中黃酮含量較高[7]，其中黃酮類成分如蘆丁[8]、槲皮素[9]、綠原酸[10]等具有降血脂、抗腫瘤、降血糖、抗氧化等生物活性，木犀草苷[11]亦有抗癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡和凋亡增敏作用。本文利用UPLC對(duì)準(zhǔn)噶爾柳花的水提取物和70%醇提取物中的黃酮成分進(jìn)行液相檢測(cè)，建立一種UPLC對(duì)準(zhǔn)噶爾柳花中的蘆丁、木犀草苷、綠原酸和槲皮素含量同時(shí)測(cè)定的方法，以期對(duì)準(zhǔn)噶爾柳花的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 藥材

準(zhǔn)噶爾柳花2016年9月采自新疆烏蘇市，經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)分析測(cè)試研究院天然產(chǎn)物所阿依古麗副研究員鑒定為楊柳科柳屬準(zhǔn)噶爾柳花，流式粉碎機(jī)粉碎過40目，待用。

1.2 試劑

蘆丁(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)100080-201408)、木犀草苷(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)111720-200604)、綠原酸(成都曼思特生物科技有限公司,批號(hào): 14091701)、槲皮素(成都曼思特生物科技有限公司,批號(hào)12020101)、無(wú)水乙醇、乙酸均為分析純，甲醇、乙腈均為色譜純，水為超純水。

1.3 儀器

超高效液相色譜儀(美國(guó)Waters)；冷凍干燥機(jī)ALPHA2-4(德國(guó)CHRIST)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI)；電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；電熱恒溫水浴鍋HHS(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)；冷卻水循環(huán)機(jī)H50(萊伯泰科公司)；流水式粉碎機(jī)DYQ-188(瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試樣品的制備

稱取凍干粉2.5 mg于25 mL的容量瓶中，甲醇溶解定容，配置成100 μg/mL的柳花水提、柳花醇提供試液。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液及混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

精密稱取對(duì)照品蘆丁、木犀草苷、綠原酸、槲皮素，分別用甲醇溶解定容至10 mL容量瓶中，搖勻，即得4個(gè)成分母液；再精密吸取蘆丁、木犀草苷、綠原酸、槲皮素母液分別用甲醇定容到10 mL，得蘆丁、木犀草苷、綠原酸、槲皮素200 μg/mL對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2.2 混合對(duì)照品的配制

分別吸取蘆丁、木犀草苷、綠原酸、槲皮素 2.5 mL，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18100 mm×2.1 mm，1.7 μm；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.2%乙酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～4 min，5%A→14%A；4～15 min，14%A→23%A；15～20 min，23%A→35%A；20～22 min，35%A→55%A；22～23 min，55%A→5%A；23～25 min，5%A)；流速：0.29 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：3 μL。

2.4 系統(tǒng)適用性考察

分別量取混合對(duì)照品溶液、供試樣品溶液注入色譜儀，記錄色譜圖(圖1)，結(jié)果蘆丁、木犀草苷、綠原酸、槲皮素與樣品中的其他成分能較好地分離。理論板數(shù)按蘆丁、木犀草苷、綠原酸、槲皮素峰計(jì)算均不低于3 000。

1 綠原酸； 2 蘆丁； 3 槲皮素； 4 木犀草苷。圖1 混合對(duì)照品和供試品溶液的色譜圖Fig.1 Chromatogram of mixed reference substance and test sample solution

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密吸取混合對(duì)照品溶液0、2、4、6、8、10 mL，分別置于10 mL的刻度比色管中，甲醇定容至刻度，搖勻，配置成系列濃度的混合對(duì)照品溶液，進(jìn)樣3 μL，測(cè)定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表1。

表1 各組分標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、線性范圍Table 1 Standard curves,correlation coefficients and linear range of each component

2.6 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取混合對(duì)照品溶液3 μL，按2.3下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定待測(cè)成分峰面積，取6次數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，得出蘆丁、木犀草苷、綠原酸、槲皮素的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果蘆丁、木犀草苷、綠原酸、槲皮素峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.86%、1.61%、1.30%、1.51%，表明儀器的精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一供試溶液室溫下放置0、1、3、5、7、9 h 后3 μL，按2.3條件進(jìn)樣，考察各化合物的穩(wěn)定性。蘆丁、木犀草苷、綠原酸、槲皮素峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.40%、1.07%、0.93%、0.78%，表明供試溶液在9 h內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

選取同一批樣品6份，精密稱量，按2.1制備供試溶液，按2.3條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算待測(cè)成分的含量。結(jié)果樣品中蘆丁含量為5.633 mg/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%；木犀草苷含量為1.841 mg/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%；綠原酸含量為0.994 mg/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.4%；槲皮素含量為2.242 mg/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6%。結(jié)果表明，方法的重復(fù)性良好。

2.9 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

精密移取混合對(duì)照溶液1 mL 6份于250 mL錐形瓶中，用氮?dú)獯蹈?，在各個(gè)錐形瓶中加入已知含量的準(zhǔn)噶爾柳花粉末0.5 g，按2.1所述制備供試溶液，按2.3所述條件進(jìn)樣，計(jì)算回收率。結(jié)果蘆丁、木犀草苷、綠原酸、槲皮素平均加標(biāo)回收率(n=6)，分別為99.9%、98.8%、97.6%、99.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6%、0.8%、1.7%、2.0%。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用PDA檢測(cè)器進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描(190 nm～450 nm)，結(jié)果360 nm處4個(gè)成分具有較大的吸收，雜質(zhì)成分干擾少，故選擇360 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。流動(dòng)相優(yōu)選甲醇-甲酸水、乙腈-甲酸水、甲醇-乙酸水、乙腈-乙酸水等流動(dòng)相系統(tǒng)，最終選擇乙腈-0.2%乙酸水溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫為洗脫方式，樣品分離度好。

含量測(cè)定時(shí)，蘆丁、木犀草苷、綠原酸、槲皮素4種成分在準(zhǔn)噶爾柳花中的含量表現(xiàn)出了較大的差異，從結(jié)果可以看出準(zhǔn)噶爾柳花中蘆丁含量最高，槲皮素含量?jī)H次于蘆丁。

本研究采用了梯度洗脫的方法同時(shí)測(cè)定柳花中蘆丁、木犀草苷、綠原酸和槲皮素的含量，不僅簡(jiǎn)單、快速，而且分離度較好、適用面廣。目前未見報(bào)道。從供試樣品色譜圖可以看出，目標(biāo)峰分離效果較好,峰面積與濃度呈正相關(guān)，精密度、 穩(wěn)定性、重復(fù)性和回收率的測(cè)定均符合實(shí)驗(yàn)要求。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可用于新疆準(zhǔn)噶爾柳花中含量的測(cè)定，為質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)及藥效的科學(xué)解釋提供了準(zhǔn)確、快速的定量分析方法，也為其質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)。從供試樣品的色譜圖中還可以看出，除已知的蘆丁、木犀草苷、綠原酸和槲皮素外，至少還有兩種含量較高的物質(zhì)有待進(jìn)一步研究確定。

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