王麗芳， 張 宇， 韓金鳴， 祝 捷， 馮加純， 鄧 暉

重癥肌無(wú)力(myasthenia gravis，MG)是累及神經(jīng)肌肉接頭突觸后膜、導(dǎo)致信息傳遞障礙的獲得性自身免疫性疾病，其發(fā)病機(jī)制主要是由乙酰膽堿受體(acetylcholinergic receptor,AChR)抗體介導(dǎo)、依賴(lài)于細(xì)胞免疫、同時(shí)有補(bǔ)體參與。已有研究發(fā)現(xiàn)多種自身免疫性疾病或免疫缺陷病的發(fā)生發(fā)展與輔助性T(T helper，Th)細(xì)胞免疫網(wǎng)絡(luò)平衡失調(diào)密切相關(guān)[1]。近年來(lái)，隨著研究的深入，越來(lái)越多的Th細(xì)胞亞型被發(fā)現(xiàn)，包括Th1、Th2、Th17、Th22以及最近報(bào)道的濾泡輔助性T細(xì)胞(follicular helper T cells，Tfh)[2]。各種Th細(xì)胞之間相互協(xié)同制約，維持機(jī)體的免疫平衡。MG是神經(jīng)系統(tǒng)典型的自身免疫性疾病，關(guān)于Tfh細(xì)胞及其細(xì)胞因子與MG發(fā)病之間的關(guān)系鮮有報(bào)道，本研究將對(duì)MG患者外周血中Tfh細(xì)胞及其細(xì)胞因子進(jìn)行研究，并結(jié)合不同Th細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子進(jìn)行全面分析，進(jìn)一步認(rèn)識(shí)輔助性T細(xì)胞在MG的發(fā)病中的作用，為未來(lái)通過(guò)調(diào)節(jié)Tfh、Th1、Th2、Th17、Th22等Th細(xì)胞之間的平衡治療MG提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 Fortessa流式細(xì)胞分析儀 (Becton,Dickinson and Company)，淋巴細(xì)胞分離液(GE公司)。BB515 Mouse Anti-Human CD4，Alexa Fluor647 Rat Anti-Human CXCR5，BV605 Mouse Anti-Human PD-1，PE Mouse Anti-Human ICOS，BV510 Mouse Anti-Human CD45RO，PerCp-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD45RA，Human IFN-γ (CBA) Flex Set，Human IL-4(CBA) Flex Set，Human IL-17A(CBA) Flex Set，Human IL-21(CBA) Flex Set(BD Biosciences)。Human IL-22 ELISA Kit (R&D systems)。

1.2 研究對(duì)象 重癥肌無(wú)力組：收集就診于吉林大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科確診為全身型MG的門(mén)診或住院患者33例。該研究經(jīng)吉林大學(xué)第一醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書(shū)。MG患者入組標(biāo)準(zhǔn)：臨床診斷為全身型MG的患者，其診斷標(biāo)準(zhǔn)包括：波動(dòng)性骨骼肌無(wú)力、疲勞試驗(yàn)陽(yáng)性、新斯的明試驗(yàn)陽(yáng)性、肌電圖低頻重復(fù)電刺激顯示低頻遞減、高頻無(wú)變化[3]；排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他自身免疫性疾??；(2)已應(yīng)用免疫調(diào)節(jié)劑(包括糖皮質(zhì)激素)治療。健康對(duì)照組：選取年齡、性別與MG患者相匹配的本院醫(yī)務(wù)人員34名，納入對(duì)象均無(wú)自身免疫病史和近期感染史。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 重癥肌無(wú)力患者定量評(píng)分及分組：根據(jù)2000年美國(guó)重癥肌無(wú)力協(xié)會(huì)(myasthenia gravis foundation of America,MGFA)提出的the quantitative myasthenia gravis score (QMGs)對(duì)納入研究的MG患者進(jìn)行評(píng)分，QMGs反映了MG患者的病情嚴(yán)重程度。根據(jù)MG患者胸腺CT掃描或胸腺病理結(jié)果，將患者分為胸腺正常組、胸腺增生組和胸腺瘤組。MG組及健康對(duì)照組年齡、性別相匹配(見(jiàn)表1)。人外周血單個(gè)核細(xì)胞和血清的制備：患者就診/入院后第2日上午8：00-10：00用肝素鈉真空抗凝管收取外周血4 ml，應(yīng)用淋巴細(xì)胞分離液制備外周血單個(gè)核細(xì)胞用于Tfh細(xì)胞的檢測(cè)，檢測(cè)需在取樣后8 h內(nèi)完成；用分離膠促凝管取外周血2 ml，通過(guò)離心獲取血清，用于IL-4、IL-17A、IFN-γ、IL-21、IL-22的檢測(cè)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血中的Tfh細(xì)胞,應(yīng)用Flow Jo 7.6.1軟件對(duì)流式檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。分別測(cè)定CXCR5+CD4+T、ICOS+CXCR5+CD4+T、PD-1+CXCR5+CD4+T、CD45RO+CXCR5+CD4+T、CD45RA+CXCR5+CD4+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例。CBA技術(shù)檢測(cè)血清中的IL-17A、IFN-γ、IL-4、IL-21，ELISA技術(shù)檢測(cè)血清中的IL-22(依說(shuō)明書(shū)操作)。

2 結(jié) 果

2.1 MG組與對(duì)照組Tfh細(xì)胞各亞群及Th相關(guān)細(xì)胞因子的比較 用Flow Jo 7.6.1軟件測(cè)定Tfh細(xì)胞各亞群占CD4+T細(xì)胞的百分率。其中CXCR5+CD4+T細(xì)胞表示總的Tfh細(xì)胞，CD45RO+CXCR5+CD4+T細(xì)胞為記憶Tfh細(xì)胞或成熟Tfh細(xì)胞，CD45RA+CXCR5+CD4+T細(xì)胞為幼稚Tfh細(xì)胞，ICOS+CXCR5+CD4+T細(xì)胞和PD-1+CXCR5+CD4+T細(xì)胞為循環(huán)Tfh細(xì)胞或功能Tfh細(xì)胞。(1)MG患者外周血中CXCR5+CD4+T細(xì)胞、CD45RO+CXCR5+CD4+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例較對(duì)照組高，差異具有顯著性(P<0.05)(見(jiàn)圖1a、b)；CD45RA+CXCR5+CD4+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例兩組之間無(wú)顯著性差異(見(jiàn)圖1c)。(2)MG患者外周血中ICOS+CXCR5+CD4+T細(xì)胞、PD-1+CXCR5+CD4+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例較對(duì)照組高，差異具有顯著性(P<0.05)(見(jiàn)圖2a、b)。(3)MG組血清中IFN-γ、IL-17A、IL-21含量較對(duì)照組增多，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)圖3a～c)。MG組血清中IL-4較對(duì)照組略有增多，IL-22較對(duì)照組含量略有降低，但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 MG組Tfh細(xì)胞及Th細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子與MG嚴(yán)重程度的相關(guān)性分析 (1)通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，ICOS+CXCR5+CD4+T細(xì)胞的數(shù)量與QMGs無(wú)相關(guān)性(見(jiàn)圖4a);PD-1+CXCR5+CD4+T細(xì)胞的數(shù)量與QMGs正相關(guān)(r=0.405,P=0.019)(見(jiàn)圖4b)。(2)MG組IL-4含量與QMGs呈負(fù)相關(guān)，差異具有顯著性(P<0.05)(見(jiàn)圖4c)；IFN-γ、IL-17A、IL-21、IL-22與QMGs無(wú)顯著相關(guān)性。(3)ICOS+CXCR5+CD4+T細(xì)胞、PD-1+CXCR5+CD4+T細(xì)胞的數(shù)量與CD45RO+CXCR5+CD4+T細(xì)胞的數(shù)量正相關(guān)(r=0.500,P=0.003；r=0.410,P=0.018)。

2.3 Tfh、IL-21、IL-4、IL-17A、IFN-γ、IL-22與胸腺的關(guān)系 根據(jù)MG患者胸腺CT掃描或胸腺病理結(jié)果，將MG患者分為胸腺正常組(8例)，胸腺增生組(10例)，胸腺瘤組(15例)。3組間Tfh細(xì)胞比例及IL-21、IL-4、IL-17A、IFN-γ、IL-22含量均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

表1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象一般資料

圖1 兩組間CXCR5+CD4+T、CD45RO+CXCR5+CD4+T、CD45RA+CXCR5+CD4+T細(xì)胞的比較

圖2 兩組ICOS+CXCR5+CD4+T、PD-1+CXCR5+CD4+T細(xì)胞的比較

圖3 MG組與對(duì)照組血清中IFN-γ、IL-17A、IL-21、IL-4、IL-22的比較

圖4 Tfh細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子與QMGs的相關(guān)性分析

3 討 論

2000年Schaerli等[2]初次在扁桃腺中發(fā)現(xiàn)了一種特殊的CD4+T細(xì)胞，其定位在淋巴濾泡，具有輔助B細(xì)胞活化成熟的功能，其特異性表達(dá)趨化因子受體(C-X-C chemokine receptor type 5，CXCR5)，被命名為濾泡輔助性T (follicular helper T,Tfh)細(xì)胞。在趨化因子CXCL13(CXCR5配體)的誘導(dǎo)下，Tfh和B細(xì)胞能共同遷移至淋巴濾泡，形成GC。目前認(rèn)為T(mén)fh細(xì)胞是輔助B細(xì)胞活化成熟的主要Th亞群，而Th1和Th2細(xì)胞的效應(yīng)因子IFN-γ、IL-4在B細(xì)胞活化和Ig類(lèi)別轉(zhuǎn)換中只發(fā)揮調(diào)節(jié)的作用。Tfh細(xì)胞輔助B細(xì)胞發(fā)生免疫反應(yīng)，主要依賴(lài)于其特異性趨化因子受體(C-X-C chemokine receptor type 5，CXCR5)、程序性死亡分子1 (programmed death 1,PD-1)、誘導(dǎo)性協(xié)同刺激因子(inducible co-stimulator,ICOS)、特異性轉(zhuǎn)錄因子bcl-6 (B cell lymphoma 6)以及其它分泌的特異性細(xì)胞因子IL-21來(lái)發(fā)揮作用。2010年，Simpson等[4]首次將CXCR5+CD4+T細(xì)胞中高表達(dá)ICOS和PD-1的Tfh細(xì)胞定義為循環(huán)的Tfh(circulating Tfh)細(xì)胞。ICOS和PD-1對(duì)GC的形成和抗體分泌細(xì)胞的產(chǎn)生都發(fā)揮著重要作用。ICOS缺陷時(shí)，外周血和GC中CXCR5+CD4+T細(xì)胞及記憶B細(xì)胞嚴(yán)重缺失[5]。PD-1為CD28家族成員，是一種重要的免疫抑制分子，Tfh細(xì)胞高表達(dá)PD-1，PD-1與其配體相互作用抑制Tfh細(xì)胞的分化。Good-Jacobson等[6]研究發(fā)現(xiàn)PD-1缺乏時(shí)，長(zhǎng)壽命漿細(xì)胞(long-lived plasma cells)數(shù)量減少，其機(jī)制為雖然PD-1的缺乏導(dǎo)致Tfh細(xì)胞數(shù)量增多，但Tfh細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-21的能力降低，進(jìn)而導(dǎo)致B細(xì)胞分化成熟減少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示全身型MG患者外周血中ICOS+CXCR5+CD4+T、PD-1+CXCR5+CD4+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例較健康對(duì)照組高，提示Tfh細(xì)胞參與了MG的發(fā)生發(fā)展，支持Luo等[7]的Tfh細(xì)胞參與了MG發(fā)病的研究結(jié)果。本研究結(jié)果還顯示PD-1+CXCR5+CD4+T細(xì)胞與QMGs正相關(guān)，進(jìn)一步證明了PD-1在全身型MG發(fā)病中可能起到致病性作用。

CD45RO+T細(xì)胞為記憶T細(xì)胞，CD45RA+T細(xì)胞為幼稚T細(xì)胞[8]。本研究結(jié)果顯示MG組ICOS+CXCR5+CD4+T、PD-1+CXCR5+CD4+T細(xì)胞比例與CD45RO+CXCR5+CD4+T細(xì)胞比例正相關(guān)，且PD-1+CXCR5+CD4+T細(xì)胞比例與QMGs正相關(guān)，說(shuō)明全身型MG患者外周血中記憶Tfh細(xì)胞越多，功能性Tfh細(xì)胞越多，患者病情越重。IL-21是Tfh細(xì)胞分泌的主要細(xì)胞因子，其對(duì)GC以及抗體的生成都起著至關(guān)重要的作用[9]。Tfh細(xì)胞也主要是通過(guò)IL-21來(lái)促進(jìn)抗體分泌細(xì)胞的形成[8]。本研究結(jié)果顯示全身型MG患者血清中IL-21含量增多，提示IL-21參與了全身型MG的發(fā)病，未來(lái)有望通過(guò)拮抗IL-21來(lái)減輕MG患者的癥狀。

IL-17主要由Th17細(xì)胞分泌，Th17在宿主防御感染及自身免疫組織炎癥中發(fā)揮重要作用。應(yīng)用抗IL-17抗體或抑制Th17細(xì)胞的分化，可以明顯減輕疾病的癥狀。Th17及其細(xì)胞因子IL-17在橋本甲狀腺炎患者外周血中增多。另外，Th17在GBS、多發(fā)性硬化、乙型肝炎、風(fēng)濕性心臟病、支氣管哮喘等疾病發(fā)病中都起到一定作用[10]。本研究結(jié)果顯示全身型MG患者外周血清中IL-17A水平較對(duì)照組增多，與王等[11]的Th17參與了MG發(fā)病的研究結(jié)果一致。由此可見(jiàn)IL-17在多種自身免疫性疾病中均可能起到促進(jìn)發(fā)病的作用，為將來(lái)自身免疫疾病的治療提供了新的方向。

IFN-γ主要是由Th1細(xì)胞分泌，主要調(diào)節(jié)IgG2a的產(chǎn)生，介導(dǎo)細(xì)胞免疫；IL-4主要由Th2細(xì)胞分泌，主要調(diào)節(jié)IgG1的產(chǎn)生，介導(dǎo)體液免疫。Th1、Th2分別通過(guò)分泌IFN-γ、IL-4實(shí)現(xiàn)相互抑制、自我增強(qiáng)的作用[12]。Th1、Th2細(xì)胞的失衡將會(huì)導(dǎo)致自身免疫性疾病、免疫缺陷病等的發(fā)生[13]。在EAE小鼠中，Th1細(xì)胞增多，Th2細(xì)胞缺乏，誘導(dǎo)或活化Th2細(xì)胞會(huì)抑制EAE或其他Th1介導(dǎo)的自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展[14]。Wu等[15]研究表明干燥綜合征小鼠經(jīng)白芍總苷治療后IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4下降，提示白芍總苷可能是通過(guò)調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡來(lái)發(fā)揮治療作用。本研究結(jié)果顯示，MG患者外周血中IFN-γ的水平較正常組升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示全身型MG患者Th1分泌IFN-γ的功能增強(qiáng)，可能起到促進(jìn)MG發(fā)病的作用；IL-4的含量較對(duì)照組略有增高，雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但I(xiàn)L-4的含量與QMGs負(fù)相關(guān)，由此我們推測(cè)IL-4在MG發(fā)病中可能發(fā)揮保護(hù)作用，減緩MG的進(jìn)展，未來(lái)我們將加大樣本量，進(jìn)一步研究IL-4與MG之間的關(guān)系。

IL-22主要由Th22細(xì)胞分泌， Zheng等[16]研究發(fā)現(xiàn)MG患者外周血中IL-17含量升高，IL-22含量降低，且IL-22含量與AchR抗體滴度負(fù)相關(guān)，推測(cè)IL-22在MG中發(fā)揮保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示MG組IL-22的水平較對(duì)照組降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且IL-22與QMGs無(wú)顯著相關(guān)性。關(guān)于Th22及其細(xì)胞因子IL-22在自身免疫性疾病中到底發(fā)揮保護(hù)作用還是致病作用有待進(jìn)一步的研究。

胸腺是T細(xì)胞發(fā)育成熟的免疫器官，其內(nèi)的生發(fā)中心是T細(xì)胞與B細(xì)胞相互作用的主要場(chǎng)所，其具備自身抗體形成的所有要素。為了探究MG患者免疫狀態(tài)與胸腺類(lèi)型的關(guān)系，我們將MG患者分為胸腺正常組、胸腺瘤組、胸腺增生組，分析3組之間Tfh細(xì)胞及IL-21、IL-4、IL-17、IL-22、IFN-γ的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3組之間無(wú)顯著性差異，但因例數(shù)較小不足以說(shuō)明問(wèn)題，下一步我們將加大樣本量，進(jìn)一步研究MG患者與胸腺類(lèi)型的相關(guān)性。

總之，我們的研究表明全身型MG患者體內(nèi)存在異常增高的Tfh細(xì)胞，并與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)，提示其可能促進(jìn)MG發(fā)病。MG患者體內(nèi)還存在異常增多的IL-21、IL-17、IFN-γ，提示它們?cè)贛G的發(fā)病中也起著促進(jìn)作用。IL-4的含量與QMGs負(fù)相關(guān)，由此我們推測(cè)IL-4在MG發(fā)病中可能發(fā)揮保護(hù)作用。將來(lái)我們將加大樣本量，并通過(guò)研究治療前后上述細(xì)胞及細(xì)胞因子的變化，進(jìn)一步明確它們?cè)贛G發(fā)病中的作用。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Wu H,Wang K,Li G,et al.Effects of transcutaneous acupoint electrical stimulation on the imbalance of Th1,Th2,Th17 and Treg cells following thoracotomy of patients with lung cancer[J].Exp Ther Med,2016,11(2):495-502.

[2]Schaerli P,Willimann K,Lang A,et al.Cxc chemokine receptor 5 expression defines follicular homing T cells with B cell helper function[J].J Exp Med,2000,192(11):1553-1562.

[3]中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)病學(xué)分會(huì)神經(jīng)免疫學(xué)組,中國(guó)免疫學(xué)會(huì)神經(jīng)免疫學(xué)分會(huì).中國(guó)重癥肌無(wú)力診斷和治療指南2015[J].中華神經(jīng)科雜志,2015,48(11):934-940.

[4]Simpson N,Gatenby PA,Wilson A,et al.Expansion of circulating T cells resembling follicular helper T cells is a fixed phenotype that identifies a subset of severe systemic lupus erythematosus[J].Arthritis Rheum,2010,62(1):234-244.

[5]Bossaller L,Burger J,Draeger R,et al.ICOS Deficiency is associated with a severe reduction of CXCR5+CD4 germinal center Th cells[J].The Journal of Immunology,2006,177(7):4927-4932.

[6]Good-Jacobson KL,Szumilas CG,Chen L,et al.PD-1 regulates germinal center B cell survival and the formation and affinity of long-lived plasma cells[J].Nat Immunol,2010,11(6):535-542.

[7]Luo C,Li Y,Liu W,et al.Expansion of circulating counterparts of follicular helper T cells in patients with myasthenia gravis[J].J Neuroimmunol,2013,256(1～2):55-61.

[8]Morita R,Schmitt N,Bentebibel SE,et al.Human blood CXCR5+CD4+T cells are counterparts of T follicular cells and contain specific subsets that differentially support antibody secretion[J].Immunity,2011,34(1):108-121.

[9]Zotos D,Coquet JM,Zhang Y,et al.IL-21 regulates germinal center B cell differentiation and proliferation through a B cell-intrinsic mechanism[J].J Exp Med,2010,207(2):365-378.

[10]Li S,Jin T,Zhang HL,et al.Circulating Th17,Th22,and Th1 cells are elevated in the Guillain-Barre syndrome and downregulated by IVIg treatments[J].Mediators Inflamm,2014,740947.

[11]王中魁,魏東寧,王 衛(wèi).Th17細(xì)胞與重癥肌無(wú)力發(fā)病及臨床嚴(yán)重度相關(guān)性研究[J].中國(guó)神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志,2013,3:167-171.

[12]Yamazaki K,Nakajima T,Hara K.Immunohistological analysis of T cell functional subsets in chronic inflammatory periodontal disease[J].Clin Exp Immunol,1995,99(3):384-391.

[13]Zhang Y,Zhang Y,Gu W,et al.Th1/Th2 cell’s function in immune system[J].Adv Exp Med Biol,2014,841:45-65.

[14]Nicholson LB,Greer JM,Sobel RA,et al.An altered peptide ligand mediates immune deviation and prevents autoimmune encephalomyelitis[J].Immunity,1995,3(4):397-405.

[15]Wu G,Wu N,Li T,et al.Total glucosides of peony ameliorates Sjogren’s syndrome by affecting Th1/Th2 cytokine balance[J].Exp Ther Med,2016,11(3):1135-1141.

[16]Zheng S,Dou C,Xin N,et al.Expression of interleukin-22 in myasthenia gravis[J].Scand J Immunol,2013,78(1):98-107.