唐飛，徐娟，邵明君

(浙江金華市中心醫(yī)院婦科，金華 321000)

眾所周知，人類內(nèi)分泌系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)互相影響，雌激素(E2)通過影響細胞因子分泌而影響免疫功能[1]。本研究通過觀察小鼠雌激素受體水平及白細胞介素13(IL-13)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)含量在不同生理階段的變化，了解雌激素水平對小鼠免疫功能的影響，為臨床雌激素治療對絕經(jīng)婦女免疫功能的影響提供實驗依據(jù)。

材料和方法

一、實驗動物

清潔級健康雌性C57BL/6小鼠60只，其中2月齡40只，10月齡20只。由杭州師范大學動物實驗中心提供(SYXK(浙)2016-0014)。

二、研究方法

1.小鼠發(fā)情間期、妊娠期和絕經(jīng)期的判定：采用陰道細胞學檢查，用小棉簽蘸取少量生理鹽水，擦取小鼠陰道內(nèi)分泌物順時針涂在載玻片上晾干，用95%酒精固定，經(jīng)蘇木精-伊紅染色后于10×10倍光鏡下觀察。若顯微鏡下見有大量白細胞及少量有核細胞為發(fā)情間期[2]，全部是無核角化細胞或間有少量上皮細胞為發(fā)情期；發(fā)情期小鼠雌雄交配后，第2天觀察陰栓形成為妊娠；于妊娠12～15 d取標本。13月齡小鼠，1天1次顯微鏡觀察陰道分泌物涂片，連續(xù)5 d內(nèi)呈現(xiàn)不規(guī)則動情周期者為絕經(jīng)期[3]。所有小鼠3月后進行實驗，實驗前4 h采用Con A(10 mg/kg)尾靜脈注射。

2.實驗分組和取材：2月齡小鼠隨機分為發(fā)情間期組、妊娠組，10月齡小鼠擬為自然絕經(jīng)組，每組20只。其中妊娠組、自然絕經(jīng)組為實驗組，發(fā)情間期組為對照組。

3. RT-PCR檢測：新鮮取得小鼠脾臟組織100 mg，經(jīng)液氮冰凍后Trizol法提取總RNA用以待測IL-13 mRNA、TNF-α mRNA和ERα、ERβ mRNA，引物由上海生工生物有限公司合成，β-actin基因作為內(nèi)參基因(引物見表1)。電泳法檢測純度，定量后取5 μg經(jīng)特異性DNA酶消化后利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國BD公司)進行逆轉(zhuǎn)錄，-20℃保存?zhèn)溆?。熒光定量PCR反應(yīng)體系(美國BD公司)如下： 熒光標記染料2×SYBR Green I Master Mix 5 μl，F(xiàn)orward primer 0.2 μl，Reverse primer 0.2 μl，小鼠脾臟 cDNA 1 μl，滅菌三蒸水補至總體積10 μl。條件為：95℃2 min；95℃ 15 s、60℃ 10 s、72℃15 s，循環(huán)數(shù)39；72℃ 5 min。將以上PCR擴增試劑加入96 孔反應(yīng)板中，3 000 r/min離心3 min，然后放入Bio-Rad CFX-384 熒光定量PCR 儀(Bio-Rad，美國)反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，應(yīng)用SDS 分析軟件(Applied Biosystems，美國) 進行分析。

表1 各引物序列

4.ELISA檢測血清E2水平：取小鼠眼眶靜脈血經(jīng)離心后(3 000 r/min)取出血清，置于-80℃低溫冰箱保存，采用雙抗體夾心ELISA法檢測各組血清E2(上海生工生物有限公司)水平。具體操作過程如下：待測樣品孔加入樣本40 μl，然后各加入抗E2抗體10 μl、鏈霉親和素-HRP 50 μl，蓋上封板膜，輕輕震蕩混勻，37℃溫育 60 min；每孔加滿洗滌液洗滌重復(fù)3次；每孔加入顯色劑100 μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10 min；最后每孔加終止液50 μl終止反應(yīng)，450 nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)繪制標準曲線，分別計算各組標本E2含量。

三、統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

一、各組小鼠血清E2水平比較

統(tǒng)計結(jié)果表明，與發(fā)情間期(對照組)小鼠[(55.23±5.11) pmol/L]比較，妊娠組小鼠血清E2水平[(82.27±8.70) pmol/L]顯著升高，自然絕經(jīng)組小鼠血清E2水平[(23.52±4.46) pmol/L]顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖1)

二、各組小鼠脾臟IL-13、TNF-α、ERα、ERβ mRNA水平的變化

與發(fā)情間期(對照組)小鼠脾臟ERα mRNA水平(2.70±1.17)比較，妊娠組脾臟ERα mRNA水平(3.93±1.54) 顯著升高，自然絕經(jīng)ERα mRNA水平(1.15±0.71)顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而三組之間ERβ mRNA水平無顯著性差異(P>0.05)(圖2)。

圖1 三組小鼠的血清E2水平

圖2 三組小鼠脾臟ERα、ERβ mRNA的表達水平

與妊娠組小鼠比較，發(fā)情間期組和自然絕經(jīng)組小鼠脾臟IL-13、TNF-α mRNA相對水平顯著升高，在自然絕經(jīng)組小鼠脾臟表達最高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖3)。

圖3 三組小鼠脾臟IL-13、TNF-α mRNA的表達水平

討 論

性激素補充治療(Hormone Replacement Therapy，HRT)對改善圍絕經(jīng)期癥狀、預(yù)防骨質(zhì)疏松和心血管疾病等的有益作用已毋庸置疑。理論上雌激素(E2)一直被認為是潛在致癌促進劑[3]，通過影響細胞增殖分化而促進腫瘤細胞生長。是否增加與性激素依賴有關(guān)的惡性腫瘤，以及此類患者在HRT 后是否會導致腫瘤復(fù)發(fā)等問題，長期以來存在廣泛爭議，相關(guān)研究表明性激素與婦女免疫功能關(guān)系密切，可能通過免疫系統(tǒng)影響腫瘤發(fā)生發(fā)展[4-7]。

TNF-α是由激活的單核巨噬細胞系列合成和釋放的一種蛋白質(zhì)，對維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定及組織更新改建起著重要調(diào)節(jié)作用。TNF-α是重要的內(nèi)源性炎癥性細胞因子，同時還是調(diào)節(jié)機體免疫功能和代謝過程的多功能細胞因子[8]。

人類IL-13具有多功能的作用，應(yīng)答細胞包括單核吞噬細胞、B細胞、大顆粒淋巴細胞和內(nèi)皮細胞。尤其IL-13通過激活單核細胞/巨噬細胞抑制促炎因子的合成，抑制單核巨噬細胞產(chǎn)生趨化因子(IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、MIP-1、IFN-q、TNF-α和G-CSF等)。IL-13具有調(diào)節(jié)單核/巨噬細胞活性的功能[9]，IL-13激活單核細胞和巨噬細胞通過誘導環(huán)氧化酶-2下調(diào)前列腺素。

機體內(nèi)環(huán)境是復(fù)雜的穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu)，E2需與受體結(jié)合后才能發(fā)揮作用，因此不同的E2效應(yīng)除了自身濃度差異以外，還與組織細胞上受體亞型及功能狀態(tài)不同抑或其他細胞因子的間接效應(yīng)有關(guān)[10]。本研究通過檢測不同生理階段小鼠中E2水平，ERα、ERβ mRNA 表達及多種免疫學指標、細胞因子的水平，以觀察體內(nèi)生理水平E2及相應(yīng)受體功能狀態(tài)對是否對各項免疫指標產(chǎn)生影響。本研究發(fā)現(xiàn)妊娠組血清E2水平明顯高于對照組(P<0.05)，自然絕經(jīng)組顯著低于對照組(P<0.05)，妊娠組血清ERα mRNA水平明顯高于對照組(P<0.05)，自然絕經(jīng)ERα mRNA明顯組低于對照組(P<0.05)；而三組ERβ mRNA水平無明顯差異(P>0.05)，提示E2與ERα結(jié)合發(fā)揮作用，與Pierdominici等[11]實驗結(jié)果一致。

細胞因子是調(diào)控蛋白質(zhì)，由不同類型的細胞產(chǎn)生，經(jīng)自分泌，內(nèi)分泌和旁分泌形式參與對外界刺激的反應(yīng)。絕經(jīng)后E2的驟然下降影響細胞因子的產(chǎn)生[12-13]。夏賢等[6-7]發(fā)現(xiàn)對絕經(jīng)婦女補充E2能明顯提高T 細胞表面ERα表達，增強CD4+T 細胞作用，達到免疫平衡狀態(tài)。TNF-α、IL-13是機體內(nèi)兩種重要的多功能細胞因子，主要由激活的巨噬細胞分泌，兩者相互促進，并與其它細胞因子相互調(diào)節(jié)。絕經(jīng)期婦女體內(nèi)IL-13、TNF-α水平升高，并且機體對此類細胞因子反應(yīng)亦增加，誘導婦女冠心病發(fā)生[14]，加速老齡化婦女骨質(zhì)丟失，與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松有關(guān)[15]。本實驗結(jié)果顯示小鼠脾臟IL-13、TNF-α mRNA相對水平表達發(fā)情間期組較妊娠組水平高(P<0.05)，三組小鼠脾臟IL-13、TNF-α mRNA相對水平在自然絕經(jīng)組表達最高(P<0.05)，提示當小鼠處于自然絕經(jīng)期，E2下降，IL-13、TNF-α mRNA因子相對水平分泌升高，而年輕時期IL-13、TNF-α mRNA因子水平分泌降低，提示E2對IL-13、TNF-α因子水平的作用可能有影響，E2是否對機體其他免疫因子的影響及其機制仍需進一步實驗證實。

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