史雅莉，郎咸忠*，馬驥，蔣美萍**

（常州大學(xué)信息科學(xué)與工程學(xué)院、數(shù)理學(xué)院，江蘇 常州 213164）

近年來，違禁抗菌藥物濫用導(dǎo)致的水產(chǎn)品安全問題日益顯著。水產(chǎn)品中殘留的抗菌類藥物不僅會使病原體產(chǎn)生耐藥性，而且部分抗菌藥物本身具有致癌、致突變等副作用[1]。特別是以結(jié)晶紫(crystal violet，CV)和孔雀石綠(malachite green，MG)為代表的三苯甲烷類染料(其分子結(jié)構(gòu)見圖1)，因價格低廉且具有良好的殺菌消毒作用而被大量應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，它們對自然環(huán)境和人類身體健康構(gòu)成極大的威脅[2]。目前，對該類物質(zhì)較為成熟可靠的檢測技術(shù)主要包括分光光度法[3]、高效液相色譜法(HPLC)[4]、液質(zhì)聯(lián)用法(LC–MS)[5]等。然而，這些技術(shù)大多基于大型固定探測設(shè)備，存在設(shè)備笨重、價格昂貴、分析時間長、檢測種類單一等缺點，并且往往需要固相萃取等復(fù)雜的前期處理過程。

圖1 兩種三苯甲烷類染料的分子結(jié)構(gòu)Figure 1 Molecular structures of two triarylmethane dyes

表面增強(qiáng)拉曼散射(surface-enhanced Raman scattering，SERS)[6]技術(shù)因具有靈敏度極高，信號響應(yīng)迅速，檢測范圍廣闊，對氣體、液體和固體都能夠直接進(jìn)行高分辨的指紋式識別等傳統(tǒng)技術(shù)無法比擬的諸多優(yōu)勢而備受關(guān)注[7-8]。SERS技術(shù)要求用于分子檢測的化學(xué)、生物傳感器材料具有寬廣的動態(tài)響應(yīng)范圍和均勻穩(wěn)定的響應(yīng)信號，因而基底方面的研究一直是該領(lǐng)域的研究熱點之一[9-11]。傳統(tǒng)的SERS基底多采用表面經(jīng)過粗糙化處理的貴金屬電極或由貴金屬納米膠體顆粒構(gòu)成的金屬島膜結(jié)構(gòu)[12-13]。這些材料的共同特點是表面結(jié)構(gòu)無序且不可控，難以在較寬的動態(tài)范圍內(nèi)獲得可靠、穩(wěn)定、均勻的SERS信號。為了解決這一問題，現(xiàn)代納米刻蝕技術(shù)[14]被用于制備有序貴金屬納米陣列。然而，這些制備手段往往存在制備成本高昂、工序繁雜、難以大面積量產(chǎn)等諸多技術(shù)弊端，大規(guī)模應(yīng)用于違禁藥物痕量檢測時受到限制。因此，尋求一種簡單、低成本的方法，用以大面積制備有序可控的高靈敏度SERS基底，已成為目前亟待解決的關(guān)鍵問題[15]。

本文提出一種以多孔陽極氧化鋁(PAA)阻擋層為模板，大面積制備有序可控的金納米帽陣列的方法，并以該陣列作為SERS基底，對典型的水產(chǎn)品違禁藥物CV和MG進(jìn)行痕量分析。該方法操作簡單、成本低廉，有望推廣用于實際水產(chǎn)品違禁藥物的痕量檢測。

1 實驗

1.1 金納米帽陣列的制備

1.1.1 多孔陽極氧化鋁的制備

1.1.1.1 鋁箔的清洗與拋光

將高純鋁箔(99.99%)置于丙酮中超聲清洗以去除表面油污，然后置于體積比為5∶1的乙醇和高氯酸混合溶液中進(jìn)行電化學(xué)拋光，電壓15 V，時間5 min。經(jīng)去離子水沖洗并氮氣吹干后，得到表面呈光滑鏡面的鋁箔。

1.1.1.2 兩步氧化法制備PAA模板

將拋光后的鋁箔置于0.5 mol/L的草酸溶液中，在不同的直流電壓(20、30、40、50或60 V)下進(jìn)行陽極氧化，時間為2 h，溫度維持在10 °C。接著將樣品置于75 °C的鉻酸和磷酸等體積混合溶液中2 h以去除之前制備的氧化鋁層，隨后再次進(jìn)行陽極氧化，時間和條件與第一次陽極氧化時相同，從而得到高度有序的PAA模板。

1.1.2 金納米帽陣列的制備

將樣品置于飽和氯化銅溶液中去除鋁基底，使PAA的阻擋層暴露出來。利用電子束蒸發(fā)鍍膜機(jī)將金沉積在PAA阻擋層表面，真空度為4 × 10?3Pa，沉積速率為0.5 ?/s，沉積厚度為30 nm，得到一系列高度有序的金納米帽陣列。

1.2 形貌表征

采用美國Veeco公司的NanoScope V型原子力顯微鏡(AFM)觀察PAA底部阻擋層的結(jié)構(gòu)，采用日本JEOL公司的JSM-633F型場發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM)觀察金納米帽陣列的形貌。

1.3 SERS光譜檢測

將金納米帽陣列浸泡于CV和MG溶液中1 h，取出后吹干，用K-Sens型便攜式光纖拉曼光譜儀(上海復(fù)享光學(xué)有限公司)進(jìn)行SERS光譜檢測，激光器的激發(fā)波長為532 nm，光譜分辨率小于5 cm?1。使用時通過調(diào)節(jié)拉曼探頭的位置，使激光垂直入射并聚焦于基底表面。設(shè)置激光器輸出功率為20 mW，時間20 s，積分2次。

2 結(jié)果與討論

2.1 PAA表面結(jié)構(gòu)表征

圖2為40 V電壓下制備的PAA底部阻擋層的AFM圖像?？梢娮钃鯇颖砻娌紳M了六角密堆排列的半球狀凸起結(jié)構(gòu)，其形成歸因于多孔陽極氧化鋁在自組裝生長過程中半球形電場和鄰近孔洞之間機(jī)械擠壓的共同作用[16-18]。這些凸起的尺寸較為均一，直徑約為100 nm，并且相鄰?fù)蛊鹬g存在一個自然的三角錐形凹槽，相鄰單元之間的最小間隙小于10 nm。這樣的納米結(jié)構(gòu)有利于構(gòu)建具有均勻分布的高密度SERS增強(qiáng)“熱點”[19-20]。

圖2 典型的多孔陽極氧化鋁阻擋層的三維AFM圖像(陽極氧化電壓為40 V)Figure 2 3D AFM image acquired from the barrier layer of a typical PAA substrate (anodization voltage = 40 V)

2.2 金納米帽陣列的形貌表征與調(diào)控

由圖3可見，金納米帽陣列呈現(xiàn)近似六角密堆排列，具有較為均一的形貌和尺寸，其中以40 V和50 V氧化電壓下制備的PAA為模板獲得的金納米帽陣列有序度最高。另外如圖4所示，金納米帽的直徑(D)隨著制備PAA模板時的陽極氧化電壓(U)的增大而呈現(xiàn)近似線性增大的趨勢，兩者之間的線性關(guān)系近似為D = 2.355U + 6.226(相關(guān)指數(shù)R2= 0.93502 )。該變化規(guī)律與模板阻擋層尺寸隨陽極氧化電壓的變化規(guī)律一致[21]。相鄰金納米帽之間具有尺寸小于10 nm的三角錐形間隙，這對于形成有效“熱點”，進(jìn)而實現(xiàn)SERS信號增強(qiáng)極為重要。這種以PAA為模板的方法能夠輕易實現(xiàn)厘米級有序金納米帽陣列的制備，并有望被應(yīng)用于制備大面積的SERS分子傳感芯片。

圖3 以不同電壓下獲得的PAA為模板制備的金納米帽陣列的SEM照片F(xiàn)igure 3 SEM images of gold nanocap arrays templated by PAA prepared at different voltages

2.3 三苯甲烷類違禁藥物的痕量檢測

圖4 金納米帽的平均直徑隨PAA模板制備時陽極氧化電壓的變化Figure 4 Average diameter of gold nanocap as a function of anodization voltage applied to preparation of PAA template

首先，選用有代表性的三苯甲烷類違禁藥CV作為檢測對象。將1 × 10?5mol/L的CV溶液自然吸附于以不同電壓制備的PAA為模板所得到的金納米帽基底上，然后檢測SERS信號。將1 × 10?2mol/L的CV溶液自然吸附于沉積有30 nm金膜的載玻片上，作為對比參照。如圖5所示，金納米帽基底呈現(xiàn)了顯著的拉曼信號增強(qiáng)，SERS光譜在300 ～ 1800 cm?1范圍出現(xiàn)了許多尖銳的峰。最顯著的幾個峰的位置在919、1179、1380、1592和1624 cm?1處，其中919 cm?1和1179 cm?1處的峰歸屬于芳環(huán)上C—H面內(nèi)彎曲振動耦合峰，1380 cm?1處的峰是由伸縮振動引起的。通過對比20 ～ 60 V的SERS基底產(chǎn)生的拉曼信號的相對峰強(qiáng)，發(fā)現(xiàn)40 V基底的增強(qiáng)效果最佳。該現(xiàn)象可歸因于以40 V陽極氧化所得PAA為模板所制備的金納米帽陣列上高度有序的高密度顆粒和適當(dāng)?shù)拈g隙產(chǎn)生了更強(qiáng)的“熱點”。

圖5 1 × 10?5 mol/L CV 溶液吸附于以不同電壓進(jìn)行陽極氧化所得PAA為模板制備的金納米帽基底時以及1 × 10?2 mol/L CV 溶液吸附于平整金箔時得到的SERS光譜Figure 5 SERS spectra of 1 × 10?5 mol/L CV solution adsorbed on the gold nanocap arrays templated by PAA prepared at different anodization voltages and 1 × 10?2 mol/L CV solution adsorbed on a flat gold sheet

為了定量描述SERS基底的信號增強(qiáng)程度，選取較為顯著的919 cm?1特征峰，按式(1)計算增強(qiáng)因子EF。

其中，ISERS和IRaman分別為違禁藥物分子表面增強(qiáng)拉曼峰強(qiáng)和普通拉曼峰強(qiáng)，NSERS和NRaman分別為表面增強(qiáng)拉曼光譜和普通拉曼光譜測定時激光光斑下分子的數(shù)量(兩者之比等于違禁藥物分子的溶液濃度之比)。通過計算發(fā)現(xiàn)，以40 V陽極氧化所得PAA為模板制備的金納米帽陣列的增強(qiáng)因子高達(dá)1.6 × 104，具有較高的檢測靈敏度。因此，選取該金納米帽陣列作為測定違禁藥物的標(biāo)準(zhǔn)SERS基底。

接下來考察CV分子在該標(biāo)準(zhǔn)基底上SERS信號的重復(fù)性。將濃度為1 × 10?5mol/L的CV溶液吸附在它之上，并隨機(jī)選取10個位置進(jìn)行SERS信號檢測，結(jié)果如圖6所示?？梢姼鱾€位置的SERS光譜的峰形、峰位和峰強(qiáng)幾乎一致，具有較好的信號重復(fù)性。根據(jù)919 cm?1處的峰強(qiáng)計算其SERS信號的相對標(biāo)準(zhǔn)差約為8.9%，足見該SERS基底具有良好的均一性，有望應(yīng)用于水產(chǎn)品違禁藥物的定量檢測。

圖6 采用在40 V下陽極氧化所得PAA模板制備的金納米帽陣列為基底測得的SERS信號的重復(fù)性Figure 6 Reproducibility of SERS spectra on the gold nanocap array templated by PAA prepared at an anodization voltage of 40 V

要實現(xiàn)違禁藥物的半定量或定量的SERS檢測，必須考察標(biāo)準(zhǔn)SERS基底的SERS信號對違禁藥物濃度的動態(tài)響應(yīng)。為了使研究分析更具有普適性，選用CV和MG這兩種典型的三苯甲烷類違禁藥物作為檢測對象。將不同濃度的CV和MG溶液分別吸附于標(biāo)準(zhǔn)SERS基底上，分析其SERS信號隨違禁藥物溶液濃度變化的響應(yīng)，結(jié)果如圖7所示?？梢娺`禁藥物分子的SERS信號強(qiáng)度隨著其溶液濃度的減小而降低，呈現(xiàn)了較大的動態(tài)響應(yīng)范圍，CV和MG分子的檢測極限都可達(dá)到10?8mol/L。另外值得指出的是，CV與MG的分子組成和結(jié)構(gòu)相近(見圖1)，因此它們的SERS光譜相似，但通過對比拉曼特征指紋譜的峰位(如CV在346 cm?1處有明顯的特征峰，而MG在該處沒有；MG在1223 cm?1處有明顯的特征峰，而CV在該處沒有)很容易將兩者的信號分辨出來。因此，采用SERS光譜技術(shù)有望實現(xiàn)真實環(huán)境中同時對多種違禁藥物的快速檢測。

圖7 不同濃度的CV和MG溶液的SERS光譜Figure 7 SERS spectra of CV and MG solutions with different concentrations

為了更明確地分析SERS信號強(qiáng)度(以I來表示)對違禁藥物的濃度(以c來表示)的動態(tài)響應(yīng)，分別對CV的919 cm?1特征峰和MG的1182 cm?1特征峰的強(qiáng)度隨溶液中兩種分子的濃度的變化進(jìn)行分析，對數(shù)據(jù)取對數(shù)后進(jìn)行線性擬合，結(jié)果如圖8所示。對于CV，lgI = ?0.35477lgc + 5.5461，R2= 0.99669；對于MG，lgI = ?0.38767lgc + 5.33774，R2= 0.97329?？梢妰煞N違禁藥物分子的SERS特征峰強(qiáng)與分子濃度近似呈線性關(guān)系，這為以金納米帽基底對違禁藥物進(jìn)行SERS痕量檢測提供了一定的參考依據(jù)。

3 結(jié)論

以多孔陽極氧化鋁阻擋層為模板，結(jié)合電子束蒸發(fā)技術(shù)，大面積地制備出一系列高度有序的金納米帽陣列。通過改變制備模板時的陽極氧化電壓，可對金納米帽形貌進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而實現(xiàn)對其表面水產(chǎn)品違禁藥物分子SERS信號的調(diào)控。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在以陽極氧化電壓為40 V時制備的模板上獲得的金納米帽陣列對CV分子具有最強(qiáng)的SERS信號增強(qiáng)效果。該SERS基底不僅對CV分子的檢測具有較高的增強(qiáng)因子和較好的重復(fù)性，且對水體中CV和MG違禁藥物分子的SERS信號具有較寬的動態(tài)響應(yīng)，信號強(qiáng)度與其濃度有明顯的線性關(guān)系，檢測極限可達(dá)到10?8mol/L。

圖8 CV的919 cm?1特征峰和MG的1182 cm?1特征峰的強(qiáng)度分別隨它們在溶液中濃度的變化Figure 8 Intensity of SERS signal for CV at 919 cm?1 and for MG at 1182 cm?1 as a function of their concentrations in test solutions

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