奶牛結(jié)核病皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)和γ-干擾素法檢測(cè)對(duì)比實(shí)驗(yàn)

李建華劉琴周亞平張泉鵬 張利坤施開平李春

（1，云南省安寧市畜牧獸醫(yī)站 650300；2，云南省昆明市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所 650041）

牛結(jié)核病是由牛型分枝桿菌等引起的一種人獸共患慢性消耗性傳染病，我國(guó)列為二類疫病。根據(jù) 《牛結(jié)核病防治技術(shù)規(guī)范》，對(duì)其采取 “監(jiān)測(cè)、檢疫、撲殺、消毒和凈化”相結(jié)合的綜合性防治。檢疫方法以牛型PPD變態(tài)反應(yīng)為主。據(jù)報(bào)道變態(tài)反應(yīng)結(jié)果受奶牛健康狀況、環(huán)境因素的影響，非結(jié)核分枝桿菌、禽結(jié)核感染，常造成假陽(yáng)性結(jié)果。目前，新的檢測(cè)方法γ-干擾素雙夾心法ELISA法已被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織 （OIE）認(rèn)可，并作為唯一的輔助診斷使用，在歐盟、美國(guó)、澳大利亞和新西蘭被批準(zhǔn)為正式試驗(yàn)。γ-干擾素ELISA原理是結(jié)核菌素PPD抗原刺激淋巴細(xì)胞后，感染牛結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞就能產(chǎn)生IFN-γ，并基于單克隆抗體的夾心ELISA檢測(cè)到。未感染牛結(jié)核分枝桿菌的淋巴細(xì)胞不會(huì)產(chǎn)生IFN-γ，因此，γ-干擾素的檢測(cè)與牛結(jié)核分枝桿菌感染相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比對(duì)單純頸部皮試變態(tài)反應(yīng) （SCT）、比較皮試變態(tài)反應(yīng) （CCT）與γ—干擾素釋放實(shí)驗(yàn) （IGRA）之間的差異，為臨床實(shí)際應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 PPD與試劑盒

皮膚實(shí)驗(yàn)用牛型PPD、禽型PPD、牛結(jié)核伽馬干擾素ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自瑞士Prionics公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)用牛

為安寧市某奶牛養(yǎng)殖小區(qū)隨機(jī)挑取75頭奶牛，同時(shí)進(jìn)行禽結(jié)核PPD、牛結(jié)核PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)，每頭牛分別注射牛型、禽型結(jié)核菌素0.1ml，72、96h觀察結(jié)果，計(jì)算皮厚差。SCT判定標(biāo)準(zhǔn)：皮厚差超過(guò)4mm判為陽(yáng)性，2～4mm為可疑，小于2mm為陰性。

CCT判定標(biāo)準(zhǔn)：如果牛型PPD的皮厚差大于禽型PPD的皮厚差且超過(guò)4mm判為陽(yáng)性，1～4mm為可疑，小于或等于禽型PPD的皮厚差為陰性。

1.3 牛γ-干擾素實(shí)驗(yàn)

采集奶牛頸靜脈血5ml，置于肝素鈉抗凝管中，輕輕顛倒混勻，使肝素鈉溶解。室溫下將血樣運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室，在采血后8h內(nèi)進(jìn)行刺激培養(yǎng)。操作參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：牛型PPD OD值-PBS OD值≥0.1，且牛型PPD OD值—禽型PPD OD值≥0.1判為陽(yáng)性；牛型PPD OD值—PBS OD值＜0.1或牛型PPD OD值—禽型PPD OD值＜0.1判為陰性。

2 結(jié)果與討論

2.1 SCT、CCT、IGRA3種方法陽(yáng)性檢出率

75頭牛的檢疫結(jié)果為SCT的檢出率為19.0%、CCT的檢出率13.3%、IGRA的檢出率為25.3%，見表1。IGRA的檢出率高于SCT、CCT，與石琴等的結(jié)論相符[1]。由于PPD變態(tài)反應(yīng)是一種遲發(fā)型超敏反應(yīng)，與機(jī)體的健康狀況有關(guān)，體制較差的奶牛反應(yīng)較慢或者反應(yīng)強(qiáng)度低。而γ-干擾素ELISA法直接刺激可以檢測(cè)結(jié)核病的期感染。用澳大利亞、美國(guó)、愛(ài)爾蘭、新西蘭、意大利和西班牙的13000頭牛進(jìn)行田間試驗(yàn)，結(jié)果表明，在γ-干擾素ELISA法診斷牛結(jié)核病時(shí)更敏感，能檢出早期感染牛。

表1 SCT、CCT、IGRA3種牛結(jié)核病檢疫方法比較

2.2 方法符合率

SCT、IGRA、CCT的結(jié)果見表2、表3。

表2 SCT、IGRA二種方法陽(yáng)性結(jié)果比較

表3 CCT、IGRA二種方法陽(yáng)性結(jié)果比較

75頭牛中SCT、IGRA共同陽(yáng)性為7頭，陽(yáng)性符合率為36.8%(7/19)， 陰性符合率91.0% （51/56）。

CCT、IGRA兩種方法的符合率，75頭牛中共同陽(yáng)性為7頭，陽(yáng)性符合率為 36.8%(7/19)，陰性符合率94.6% （53/56）。與陳祥、倪谷音、鄧永強(qiáng)的結(jié)果差異較大[2-4]，差異來(lái)源于奶牛體況，試劑盒差異，以及操作規(guī)范性。

CCT與SCT相比，陽(yáng)性奶牛數(shù)減少2頭，陽(yáng)性符合率100% （10/10）， 陰性符合率 96.9% （63/65），SCT假陽(yáng)性率為16.7% （2/12），即采用CCT法可以減少由于禽結(jié)核分枝桿菌造成的假陽(yáng)性。

3 結(jié)論

（1）3種方法相比，本實(shí)驗(yàn)IGRA的檢出率最高，SCT次之，CCT最低。因此，在奶牛檢疫中，為避免由于禽結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌造成假陽(yáng)性導(dǎo)致的奶牛誤殺，應(yīng)采取雙皮試法進(jìn)行檢疫。另外，鑒于皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)不能診斷出早期感染的奶牛，對(duì)于檢出可疑的奶牛應(yīng)在3個(gè)月內(nèi)復(fù)檢，每年開展2次檢疫，對(duì)檢出的陽(yáng)性牛按規(guī)定進(jìn)行處置，并嚴(yán)格按照要求對(duì)結(jié)核病陽(yáng)性牛進(jìn)行隔離、撲殺，對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行徹底消毒，堅(jiān)持自繁自養(yǎng)，經(jīng)過(guò)幾年就可以凈化奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)結(jié)核病。

（2）γ-干擾素ELISA法能檢出早期感染的奶牛，在體外避免繁瑣操作造成的誤差，可操作性很強(qiáng)。但該法也存在不足之處，即試劑盒價(jià)格高，按一個(gè)試劑盒做480頭奶牛計(jì)算，一頭牛需要試劑費(fèi)用70元以上，是皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)的10倍。因此，在采用γ-干擾素ELISA法時(shí)，最好先進(jìn)行雙皮試反應(yīng)，陽(yáng)性奶牛再進(jìn)行采用γ-干擾素ELISA法復(fù)查，均為陽(yáng)性的采取撲殺措施。

（3）本實(shí)驗(yàn)在進(jìn)行γ-干擾素ELISA時(shí)還發(fā)現(xiàn)，該法對(duì)檢測(cè)人員的熟練操作性要求很強(qiáng)，加樣量和速度快慢、試劑加注、洗板、反應(yīng)時(shí)間等均會(huì)影響檢測(cè)的重復(fù)性。重復(fù)性不好時(shí)，同一個(gè)樣品OD可能大于或小于0.1，造成判斷的誤差。因此，在進(jìn)行γ-干擾素ELISA法操作時(shí)，要嚴(yán)格按照操作步驟進(jìn)行，最好每個(gè)樣品做重復(fù)。

參考文獻(xiàn):

[1]石琴,袁立崗,蒲敬偉,等.不同監(jiān)測(cè)方法在奶牛結(jié)核病檢疫中的應(yīng)用[J].中國(guó)奶牛,2017(1):33-35：

[2]陳祥,徐正中,時(shí)振華,等.γ-干擾素試驗(yàn)和皮試變態(tài)反應(yīng)對(duì)檢測(cè)奶牛結(jié)核病的比較[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2011,27(2):97-100.

[3]倪谷音,毛愛(ài)民.γ-干擾素釋放法檢測(cè)奶牛結(jié)核病的比較試驗(yàn)[J].中國(guó)動(dòng)物檢疫,2014(1):64-66

[4]鄧永強(qiáng),陽(yáng)愛(ài)國(guó),郭莉,等.應(yīng)用皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)和γ-干擾素體外釋放試驗(yàn)檢測(cè)奶牛結(jié)核病的比較研究[J].中國(guó)奶牛,2014(8):23-25.