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      銀黃滴丸制劑提取物抗口腔潰瘍的藥效學(xué)研究

      2018-05-11 12:04:42劉新輝孔小強(qiáng)胡鵬翼趙準(zhǔn)沈漢福吳建明劉秀娟廖正根朱金華高書(shū)亮余日躍江西中醫(yī)藥大學(xué)南昌330004浙江維康藥業(yè)股份有限公司浙江麗水33000江西省中藥藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室南昌330004
      江西中醫(yī)藥 2018年5期
      關(guān)鍵詞:銀黃滴丸家兔

      ★劉新輝 孔小強(qiáng) 胡鵬翼 趙準(zhǔn) 沈漢福 吳建明 劉秀娟 廖正根 朱金華 高書(shū)亮 余日躍,3**(.江西中醫(yī)藥大學(xué) 南昌 330004;.浙江維康藥業(yè)股份有限公司 浙江 麗水33000;3.江西省中藥藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南昌 330004)

      口腔潰瘍(oral ulcer)是口腔黏膜病中最常見(jiàn)的疾病,患病率高達(dá)20%左右,居口腔粘膜病的首位。主要表現(xiàn)為口腔粘膜反復(fù)出現(xiàn)孤立的、圓形或橢圓形的潰瘍,潰瘍表淺,呈淡黃色,或白色,邊緣整齊,周?chē)@以紅暈,可單發(fā)或多發(fā),有明顯的灼痛。發(fā)病不受年齡限制,以青年為多,女性略多于男性,一年四季均能發(fā)生,冬春季較多。動(dòng)物模型的建立是研究疾病病因、機(jī)制及治療等的重要手段,國(guó)內(nèi)外對(duì)口腔潰瘍動(dòng)物模型的建立做了大量的研究和論證[1]。口腔潰瘍模型的建立方法多樣,本實(shí)驗(yàn)采用細(xì)菌感染誘導(dǎo)法和化學(xué)物質(zhì)灼燒法。

      1 材料

      1.1 動(dòng)物 日本大耳兔(南昌龍平兔業(yè)有限公司,許可證號(hào)scxk(贛)2014-0005),雌雄兼用,體重2kg左右。

      1.2 設(shè)備 包埋機(jī)(EG1150,徠卡公司);切片機(jī)(RM2235,徠卡公司);倒置熒光顯微鏡(IBE2000,徠卡公司);內(nèi)窺鏡等。

      1.3 試藥與試劑 銀黃滴丸制劑前提取的金銀花提取物和黃芩提取物(浙江維康藥業(yè)股份有限公司提供,批號(hào):B160505)。梔子金花丸(天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司樂(lè)仁堂制藥,批號(hào):C145065)。金黃色葡萄球菌ATCC25923(江西省臨床檢驗(yàn)中心)、苯酚溶液。

      2 方法

      2.1 藥液配制

      2.1.1 供試液 銀黃滴丸制劑提取物(金銀花∶黃芩=5∶2)成人臨床劑量為24mg/kg,按體表面積折算家兔劑量為78.4mg/kg。擬設(shè)家兔的低、中、高劑量分別為78.4、156.8和313.6mg/kg。梔子金花丸為陽(yáng)性藥,家兔劑量為420.43mg/kg。各藥液均用蒸溜水配成10mL/kg的混懸液,常溫保存,用前搖勻。

      2.1.2 金黃色葡萄球菌溶液 取得金黃色葡萄球初始濃度為8.17×108cfu/mL,加生理鹽水稀釋至2.17×103cfu/mL,4℃冰箱儲(chǔ)存,備用。

      2.2 口腔潰瘍的制備

      2.2.1 感染性口腔潰瘍 取家兔48只,體重為2~3kg,雌雄各半,取40只家兔在其下牙床后部用鑷子造成黏膜20mm2左右的創(chuàng)傷,再用滴管滴一滴濃度為2.17×103cfu/mL的金黃色葡萄球菌溶液于創(chuàng)面,每日用沾有金黃色葡萄球菌溶液的鑷子刺激創(chuàng)面一次,連續(xù)3天,創(chuàng)面出現(xiàn)潰瘍面(白色或淡黃色假膜覆蓋)[2],并用內(nèi)窺鏡拍照,記錄潰瘍面大小。其余8只家兔為空白對(duì)照。

      2.2.2 化學(xué)物質(zhì)灼傷口腔潰瘍 另取家兔36只,體重為2~3kg,雌雄各半,從中取30只家兔造模,將一小棉球置于直徑為5mm的玻璃管一端(使之與管口平齊),再將玻璃管塞棉球一端蘸900g/L苯酚溶液,灼燒家兔左側(cè)面頰60s,24h后觀察,家兔口腔黏膜上均出現(xiàn)直徑5mm的潰瘍面[3]。內(nèi)窺鏡拍照,記錄潰瘍面大小。其余6只家兔為空白對(duì)照。

      2.3 給藥與觀察 40只感染性口腔潰瘍家兔,隨機(jī)分為5組,分別為陽(yáng)性藥組、低劑量組、中劑量組、高劑量組和模型組。另8只未造模為空白組。每組家兔按相應(yīng)劑量灌胃,給藥體積為10mL/kg,每天給藥一次,連續(xù)3天,模型組和空白組給相應(yīng)的蒸溜水。30只苯酚灼傷口腔潰瘍家兔,隨機(jī)均勻分為5組,分別為陽(yáng)性藥組、低劑量組、中劑量組、高劑量組和模型組。另6只未造模為空白組。給藥方法同2.3,連續(xù)給藥6天。家兔給藥前拍照其潰瘍面,記錄其大小。治愈率%=(給藥前面積-給藥后面積/給面藥前面積)%。

      2.4 病理觀察 給藥末次24h后處死家兔,剪取家兔潰瘍組織,生理鹽水洗凈組織,空白組同理操作。并分裝放入10%的中性甲醛中固定48h左右,分組,編號(hào)。組織進(jìn)行脫水、浸蠟、包埋,以4μm厚度組織橫斷面切片,常規(guī)HE染色,組織封片,倒置熒光顯微鏡拍照觀察,記錄結(jié)果。

      2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS20.0軟件處理,數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用單因素方差分析比較組間差異,P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

      3 結(jié)果

      3.1 銀黃滴制劑提取物對(duì)家兔口腔潰瘍假膜的治療作用 對(duì)內(nèi)窺鏡照片進(jìn)行肉眼觀察,給藥前,各組家兔均在口腔破潰處有一塊面積較大的白色或淡黃色的假膜,說(shuō)明口腔潰瘍形成并非常明顯;與給藥第3天或第6天比較,除模型組外,其余各組家兔給藥后口腔潰瘍均出現(xiàn)一定的愈合,呈現(xiàn)顯著的藥效,而模型組有輕微的愈合。

      3.2 銀黃滴丸制劑提取物對(duì)家兔口腔潰瘍面積的愈合作用 通過(guò)PS軟件對(duì)上述2.5內(nèi)窺鏡照片進(jìn)行治愈面積計(jì)算,從造模成功后開(kāi)始拍照記錄到給藥結(jié)束,治療過(guò)程中潰瘍恢復(fù)的程度,即為治愈率。分別計(jì)算金黃色葡萄球菌所致的口腔潰瘍治治愈率和化學(xué)物質(zhì)灼傷所致的口腔潰瘍治治愈率,結(jié)果見(jiàn)表1和表2。

      表1 銀黃滴丸制劑提取物對(duì)金黃色葡萄球菌所致的口腔潰瘍治愈率(,n=8)

      表1 銀黃滴丸制劑提取物對(duì)金黃色葡萄球菌所致的口腔潰瘍治愈率(,n=8)

      注:與模型組相比,*P<0.05,**P<0.01。

      組別 給藥前面積/mm2給藥后面積/mm2 治愈率/%空白組 0.00±0.00 0.00±0.00** 0.00±0.00**模型組 19.58 ±2.67 13.44 ±2.9 31.16 ±13.18陽(yáng)性藥組 19.44 ±6.84 2.52 ±0.79** 84.53±7.53**低劑量組 19.56 ±8.45 8.19 ±2.62* 31.16 ±13.18*中劑量組 19.54 ±9.73 6.97 ±5.52** 67.98±21.38**高劑量組 20.17 ±22.00 5.37 ±3.85** 77.13±19.46**

      表2 銀黃滴丸制劑提取物對(duì)化學(xué)物質(zhì)灼傷所致的口腔潰瘍治愈率(,n=6)

      表2 銀黃滴丸制劑提取物對(duì)化學(xué)物質(zhì)灼傷所致的口腔潰瘍治愈率(,n=6)

      注:與模型組相比,*P<0.05,**P<0.01。

      組別 給藥前面積/mm2給藥后面積/mm2 治愈率/%空白組 0.00±0.00 0.00±0.00** 0.00±0.00**模型組 7.53±1.05 5.80±1.43 31.16 ±13.18陽(yáng)性藥組 7.39±1.04 3.62±1.14* 84.53±7.53**低劑量組 7.68±1.55 4.01±0.93* 31.16 ±13.18*中劑量組 7.43±1.56 2.96±0.93** 67.98±21.38**高劑量組 7.45±1.89 3.40±1.56* 77.13±19.46**

      3.3 組織病理學(xué)

      3.3.1 銀黃滴丸制劑提取物對(duì)金黃色葡萄球菌所致家兔口腔潰瘍病理學(xué)影響 顯微鏡下放大10倍物鏡,觀察各組家兔潰瘍組織病理變化。結(jié)果表明,模型組上皮組織結(jié)構(gòu)不清晰,有變性、壞死、缺失,粘膜表面有炎性分泌物,并有血痂形成,粘膜下局部有充血、水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與模型組比較,陽(yáng)性藥組個(gè)別家兔局部皮下有充血現(xiàn)象;空白組無(wú)明顯病理性改變;低、中、高劑量組上皮有局部變性、壞死,粘膜下局部有充血、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。結(jié)果見(jiàn)圖1。

      3.3.2 銀黃滴丸制劑提取物對(duì)化學(xué)物質(zhì)灼傷所致家兔口腔潰瘍病理學(xué)影響 顯微鏡下放大10倍物鏡,觀察各組家兔潰瘍組織病理變化。結(jié)果表明,模型組粘膜層損傷明顯,上皮細(xì)胞脫落缺損,局部有細(xì)胞變性、壞死等病理性改變,粘膜及粘膜下可見(jiàn)充血、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與模型組比較,陽(yáng)性藥組病理性損傷明顯減輕,上皮組織無(wú)明顯壞死;空白組組織結(jié)構(gòu)正常,粘膜層完整無(wú)損;低、中、高劑量組病理性損傷減輕,上皮組織可見(jiàn)局部變性、壞死,局部粘膜下有充血及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。結(jié)果見(jiàn)圖2。

      圖1 銀黃滴丸制劑提取物對(duì)金黃色葡萄球菌所致家兔口腔潰瘍病理學(xué)影響

      圖2 銀黃滴丸制劑提取物對(duì)化學(xué)物質(zhì)灼傷所致家兔口腔潰瘍病理學(xué)影響

      4 討論

      口腔潰瘍(oral ulcers)俗稱(chēng)“口瘡”,常見(jiàn)的發(fā)生于口腔黏膜的潰瘍性損傷病癥,多見(jiàn)于唇內(nèi)側(cè)、頰黏膜、前庭溝、軟腭等部位,這些部位的黏膜缺乏角質(zhì)化層或角化較差,從而易引起口腔潰瘍[3]。

      銀黃滴丸制劑提取物的主要成分為金銀花和黃芩。金銀花為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花。夏初花開(kāi)放前采收,干燥。具有清熱解毒,疏散風(fēng)熱功能。主治癰腫疔瘡,喉痹,丹毒,熱毒血痢,風(fēng)熱感冒,溫病發(fā)熱[4]。趙良忠等[5]研究表明,金銀花提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌、青霉、黃曲霉、黑曲霉有一定的一致作用,并研究表明,加熱處理可強(qiáng)化金銀花提取物的抑菌效果,確定了最佳工藝條件,金銀花提取物抑菌作用更為明顯。Lee等[6]證實(shí)了金銀花中的兩個(gè)單體化合物L(fēng)oniceroside A和Lonicerin具有顯著的抗炎止痛作用。

      黃芩為唇形科植物黃芩Scutellariabaicalensis Georgi的干燥根。春、秋二季采挖,除去須根和泥沙,曬后撞去粗皮,曬干。具有清熱燥濕,瀉火解毒,止血,安胎功能,主治血熱吐衄,癰腫瘡毒等[7]。Li等[8]將黃芩應(yīng)用于體外抗菌試驗(yàn),結(jié)果表明,黃芩對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌等多種細(xì)菌均有一定的抑制作用。李倩楠等[9]研究表明,黃芩苷對(duì)發(fā)熱大鼠具有解熱作用,觀察藥后各組體溫變化率與IL-6、IL-1、βTNF-α含量變化率作相關(guān)性分析,結(jié)果表明黃芩苷有顯著的解熱作用,七解熱機(jī)制與TNF-α和IL-1β的含量減少密切的有關(guān)。

      因此本實(shí)驗(yàn)結(jié)合金銀花和黃芩的藥理作用對(duì)兩者聯(lián)合用藥,實(shí)驗(yàn)表明,銀黃滴丸制劑提取物對(duì)金黃色葡萄球菌所致家兔口腔潰瘍有明顯的治療作用。另一部分,雖兩藥在化學(xué)物質(zhì)灼傷所致家兔口腔潰瘍方面報(bào)道甚少,但通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明,銀黃滴丸制劑提取物對(duì)化學(xué)物質(zhì)灼傷所致家兔口腔潰瘍也有明顯的治療作用。而在機(jī)制作用方面,根據(jù)Xiao Y等研究表明,Jinkoubao能大大改善家兔口腔癥狀并兔并促進(jìn)其愈合,作者認(rèn)為這可能是通過(guò)調(diào)節(jié)表皮生長(zhǎng)因子水平,加強(qiáng)口腔潰瘍的修復(fù)能力[10]。本實(shí)驗(yàn)僅銀黃滴丸制劑提取物對(duì)家兔進(jìn)行形態(tài)學(xué)研究和藥效學(xué)研究,其在機(jī)制方面的作用有待進(jìn)一步探究。

      參考文獻(xiàn)

      [1]Seko K, Kagami H, Senga K, et al. Effects of ovariectomy and estrogen replacement on rat oral mucosa [J]. Maturitas, 2005, 50(1):44-51.

      [2]田景振,王靜.冰硼貼片的藥理作用及對(duì)動(dòng)物口腔正常粘膜影響的研究[J]. 山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 1995(2):79-80.

      [3]朱萱萱,王廣基,劉建平,等.口腔膜治療實(shí)驗(yàn)性大鼠口腔潰瘍作用機(jī)理研究[J]. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊, 2003, 21(1):84-85.

      [4]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典·一部[S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2015:221.

      [5]趙良忠,蔣賢育,段林東,等. 金銀花水溶性抗菌物質(zhì)的提取及其抑菌效果研究[J]. 中國(guó)生物制品學(xué)雜志, 2006, 19(2):201-203.

      [6]Lee SJ. Anitrinflammatoryactivity of the major constituents of Lonicerajaponical [J]. Arch Pharm Res, 1995, 18(2):133-135.

      [7]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典·一部[S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2010:283.

      [8]Li Y C, Shen J D, Li J, et al. Chronic treatment with baicalin prevents the chronic mild stress-induced depressive-like behavior: involving the inhibition of cyclooxygenase-2 in rat brain [J]. Progress in Neuropsychopharmacology& Biological Psychiatry, 2013, 40(2):138-143.

      [9]李倩楠,葛曉群.黃芩苷的解熱作用及對(duì)細(xì)胞因子的影響[J]. 中國(guó)中藥雜志, 2010, 35(8):1 068-1 072.

      [10]Xiao Y, Chen Q, Su S, et al. Effect of Jinkoubao on rabbit oral ulcer model [J]. Chongqing Medicine, 2017, 46(7):886-888.

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